本文關(guān)鍵詞： 肝細(xì)胞生長因子 轉(zhuǎn)化生長因子-β1 結(jié)締組織生長因子 α-平滑肌肌動(dòng)蛋白 骨骼肌纖維 纖維化　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的 建立一種高效的骨骼肌細(xì)胞分離培養(yǎng)的方法，并在此基礎(chǔ)上觀察轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor beta-1，TGF-β1）誘導(dǎo)的骨骼肌細(xì)胞纖維化轉(zhuǎn)型的作用，探討肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)調(diào)控TGF-β1誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞纖維化轉(zhuǎn)型的作用及機(jī)制，為臨床治療失神經(jīng)喉肌纖維化提供一種新策略和理論依據(jù)。 方法 1、骨骼肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)組采用經(jīng)腹主動(dòng)脈II型膠原酶灌注法消化骨骼肌，取材C57BL/6小鼠趾長伸肌，D-Hanks液沖洗后移入試管以I型膠原酶和II型膠原酶聯(lián)合振蕩消化；對(duì)照組小鼠處死后直接取趾長伸肌，D-Hanks液沖洗后用I型膠原酶振蕩消化，以廣口吸管研磨肌腹使肌細(xì)胞徹底松散。顯微鏡下對(duì)兩種分離方法獲得的骨骼肌細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，各組均選取完整存活的肌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，不同時(shí)間點(diǎn)觀察存活率。 2、 TGF-β1誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞纖維化轉(zhuǎn)型的作用及機(jī)制 C2C12細(xì)胞以分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)融合為肌管，分化培養(yǎng)72小時(shí)后更換培養(yǎng)液為不含血清的DMEM，分別給予不同濃度TGF-β1（0ng/ml,0.1ng/ml,1ng/ml,5.0ng/ml）進(jìn)行干預(yù)，12h后實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測各組CTGF和α-SMA在轉(zhuǎn)錄水平的變化，Western blot檢測CTGF和α-SMA在蛋白水平表達(dá)變化。 骨骼肌細(xì)胞分離后培養(yǎng)24小時(shí)，選取存活且狀態(tài)良好的肌細(xì)胞隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組給予TGF-β1（0.5ng/ml）進(jìn)行干預(yù)。12小時(shí)后實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測各組CTGF mRNA和α-SMAmRNA的變化，Western blot檢測CTGF和α-SMA蛋白表達(dá)變化。 3、 HGF調(diào)控TGF-β1誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞纖維化轉(zhuǎn)型的作用及機(jī)制 將分離培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞隨機(jī)分成三組：①空白對(duì)照組②TGF-β1（0.5ng/ml）誘導(dǎo)組（HGF未干預(yù)組）③HGF（4ng/ml）和TGF-β1（0.5ng/ml）共同干預(yù)組，12小時(shí)后實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測各組CTGF mRNA和α-SMA mRNA的變化，間接免疫熒光法和Western blot檢測CTGF和α-SMA蛋白分布和表達(dá)水平。 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。先進(jìn)行各組方差齊性檢驗(yàn)，符合方差齊性條件，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(ANOVA)和t檢驗(yàn)；不符合方差齊性條件，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1、兩種分離方法獲得的骨骼肌細(xì)胞的數(shù)量、生存率 %s5物鏡下平均每個(gè)視野灌注法獲得的肌細(xì)胞數(shù)為（32.17士2.09）根，研磨法獲得的肌細(xì)胞數(shù)為（10.58士1.15）根，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。24h灌注法肌細(xì)胞存活率是研磨法的3.20倍，48h灌注法肌細(xì)胞存活率是研磨法的2.76倍，72h灌注法肌細(xì)胞存活率是研磨法的2.75倍，各時(shí)間點(diǎn)生存率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。但灌注法操作時(shí)間比研磨法長，且膠原酶消耗大，實(shí)驗(yàn)成本高。 2、TGF-β1誘導(dǎo)肌管纖維化轉(zhuǎn)型作用及機(jī)制 不同濃度TGF-β1干預(yù)下，肌管CTGF mRNA表達(dá)量較空白對(duì)照組均增高，在1ng/ml濃度時(shí)表達(dá)量最高為空白對(duì)照組的16.03倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；不同濃度TGF-β1干預(yù)下肌管α-SMAmRNA表達(dá)量較空白對(duì)照組均增高，在1ng/ml濃度時(shí)表達(dá)量最高是空白對(duì)照組的4.52倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。肌管CTGF蛋白表達(dá)量較空白對(duì)照組均增高，在1ng/ml濃度時(shí)表達(dá)量最高是空白對(duì)照組的1.88倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；肌管α-SMA蛋白表達(dá)量較空白對(duì)照組均增高，在1ng/ml濃度時(shí)表達(dá)量最高是空白對(duì)照組的1.59倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 3、TGF-β1誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞纖維化轉(zhuǎn)型的作用及機(jī)制 TGF-β1誘導(dǎo)下骨骼肌細(xì)胞CTGF mRNA的表達(dá)是空白對(duì)照組9.55倍，α-SMAmRNA的表達(dá)是空白對(duì)照組26.82倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。TGF-β1誘導(dǎo)下骨骼肌細(xì)胞CTGF蛋白的表達(dá)是空白對(duì)照組3.63倍，α-SMA蛋白的表達(dá)是空白對(duì)照組3.38倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 4、HGF調(diào)控TGF-β1誘導(dǎo)的骨骼肌細(xì)胞纖維化轉(zhuǎn)型的作用及機(jī)制 HGF干預(yù)后CTGF和α-SMA mRNA的表達(dá)量明顯下降，TGF-β1誘導(dǎo)組（HGF未干預(yù)組）CTGFmRNA表達(dá)量是HGF干預(yù)組6.57倍，TGF-β1誘導(dǎo)組（HGF未干預(yù)組）α-SMAmRNA表達(dá)量是HGF干預(yù)組2.64倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。HGF干預(yù)后CTGF和α-SMA蛋白表達(dá)量也下降，TGF-β1誘導(dǎo)組（HGF未干預(yù)組）CTGF蛋白表達(dá)量是HGF干預(yù)組2.21倍，，TGF-β1誘導(dǎo)組（HGF未干預(yù)組）α-SMA蛋白表達(dá)量是HGF干預(yù)組1.49倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。各組骨骼肌細(xì)胞CTGF和α-SMA免疫熒光均檢測到陽性信號(hào)，以TGF-β1誘導(dǎo)組（HGF未干預(yù)組）信號(hào)最強(qiáng)，HGF干預(yù)后信號(hào)較TGF-β1誘導(dǎo)組（HGF未干預(yù)組）減弱。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論： 1、采用膠原灌注法獲得骨骼肌細(xì)胞數(shù)量多，存活率高，比原有方法更具優(yōu)勢(shì)。但此法操作時(shí)間長，流程較繁瑣，需要長期反復(fù)實(shí)踐摸索。 2、TGF-β1可促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞和肌管CTGF、α-SMA在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的表達(dá)，在骨骼肌表型轉(zhuǎn)化進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。 3、HGF可以調(diào)控TGF-β1誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞表達(dá)CTGF和α-SMA，抑制其表型轉(zhuǎn)化，為治療失神經(jīng)喉肌細(xì)胞化在細(xì)胞和分子水平提供了依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：1493174