本文關鍵詞： 腸道病毒71型 自噬 凋亡 病毒復制　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2011年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：近年來由腸道病毒71型(Enterovirus 71, EV71)感染而引起的手足口病發(fā)病人數(shù)在我國呈大幅上升趨勢,缺乏合適的疫苗及有效的抗病毒藥物是控制EV71感染的主要障礙。而EV71致病機制的闡明無疑是解除這兩個障礙的有力手段。但到目前為止,EV71致病機制尚不明確。自噬和凋亡在病毒感染中起著關鍵的作用,一方面可以通過降解病毒成分,遞呈病毒抗原,激活機體免疫反應,從而達到清除病毒的目的；另一方面,病毒也可利用對自噬和凋亡的調控逃逸機體的抗病毒作用,維持自身的存活和復制。研究表明,EV71可誘導細胞發(fā)生自噬,也可誘導細胞發(fā)生凋亡,但自噬和凋亡的相互調控機制尚不明確。病毒感染細胞后,可引起細胞死亡,但同時病毒又必須借助活的細胞完成自身的復制過程。而目前EV71感染誘導的細胞自噬和凋亡對EV71病毒復制和顆粒釋放的影響尚不明確。 本實驗中,我們首先證實了EV71 (Fuyang-0805)病毒株能夠誘導RD-A細胞發(fā)生自噬和凋亡,然后研究了EV71誘導細胞自噬及凋亡對病毒產(chǎn)生和釋放的影響,在此基礎上進一步探討了EV71誘導細胞自噬和凋亡的相互調控關系。 實驗結果顯示,EV71活病毒可誘導RD-A發(fā)生自噬,隨著感染時間的延長和感染劑量的增加,自噬水平逐漸增強。自噬不同階段的抑制劑能夠抑制由EV71病毒感染誘導細胞自噬的相應階段。10μM的3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)能夠抑制EV71誘導的細胞自噬,同時還能夠降低細胞培養(yǎng)上清中EV71病毒的滴度。EV71的活病毒能夠誘導細胞發(fā)生凋亡,隨著感染時間的延長和感染劑量的增加,凋亡水平逐漸增加。凋亡蛋白酶通用抑制劑Z-VAD-FMK能夠抑制EV71誘導的凋亡,同時也可以抑制EV71病毒顆粒的產(chǎn)生和釋放。另外,我們通過自噬和凋亡抑制劑的使用以及siRNA干擾自噬和凋亡相關分子的表達,研究EV71誘導的自噬和凋亡的相互調控關系。結果證明,抑制自噬體的形成可以抑制細胞發(fā)生凋亡,而抑制自噬溶酶體的活性卻促進了凋亡的發(fā)生。同時,抑制凋亡可以促進EV71誘導的細胞自噬的發(fā)生,促進凋亡可以抑制EV71誘導的細胞自噬,凋亡底物PARP (poly ADP-ribose polymerase, PARP)減少可以抑制EV71感染誘導的細胞自噬。 以上結果提示,通過使用合適劑量的抑制劑或誘導劑調控EV71誘導的自噬和凋亡來影響病毒顆粒的釋放,從而降低病毒毒力,緩解EV71病毒引發(fā)的疾病可能會為尋找新的抗EV71藥物提供新的思路。
[Abstract]:In recent years, the number of HFMD cases caused by enterovirus 71 (EV71) infection in China is on the rise. The lack of appropriate vaccine and effective antiviral drugs are the main obstacles to the control of EV71 infection. The elucidation of the pathogenesis of EV71 is undoubtedly a powerful means to remove these two obstacles. But so far. The pathogenesis of EV71 is unclear. Autophagy and apoptosis play a key role in viral infection. On the one hand, autophagy and apoptosis can activate immune response by degrading viral components and presenting virus antigen. In order to achieve the purpose of eliminating the virus; On the other hand, the virus can also use the regulation of autophagy and apoptosis to escape the body's anti-virus effect, maintain its own survival and replication. Apoptosis can also be induced, but the mechanism of autophagy and apoptosis is not clear. Virus infection can cause cell death. But at the same time, the virus must use living cells to complete its own replication process, but the effect of autophagy and apoptosis induced by EV71 infection on the replication and particle release of EV71 virus is not clear. In this study, we first confirmed that EV71 Fuyang-0805) could induce autophagy and apoptosis in RD-A cells. Then the effects of EV71 induced autophagy and apoptosis on the production and release of virus were studied, and the relationship between autophagy and apoptosis induced by EV71 was further discussed. The results showed that EV71 virus could induce autophagy of RD-A with the increase of infection time and dose. Autophagy level gradually increased. Inhibitors at different stages of autophagy could inhibit the corresponding stage of autophagy induced by EV71 virus infection. 3-methyladenine. 3-MA) can inhibit autophagy induced by EV71 and decrease the titer of EV71 virus in cell culture supernatant. EV71 live virus can induce apoptosis of cells. With the prolongation of infection time and the increase of infection dose, the level of apoptosis gradually increased. Z-VAD-FMK, a common inhibitor of apoptotic protease, could inhibit the apoptosis induced by EV71. We also inhibit the production and release of EV71 virus particles. In addition, we interfere with the expression of autophagy and apoptosis-related molecules through the use of autophagy and apoptosis inhibitor and siRNA. To study the relationship between autophagy and apoptosis induced by EV71. The results showed that inhibiting the formation of autophagy could inhibit apoptosis, while inhibiting the activity of autophagy could promote apoptosis. Inhibition of apoptosis can promote autophagy induced by EV71, and promote apoptosis can inhibit autophagy induced by EV71. The reduction of apoptosis substrate PARP ADP-ribose polymerase (parp) inhibited autophagy induced by EV71 infection. These results suggest that EV71 induced autophagy and apoptosis can be controlled by appropriate dose of inhibitors or inducers to affect the release of virus particles and thus reduce the virulence of the virus. Alleviating the disease caused by EV71 may provide new ideas for finding new anti-EV71 drugs.
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R373

【共引文獻】

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