本文關(guān)鍵詞： 西尼羅病毒 復(fù)制子 DNA疫苗 免疫原性　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：西尼羅病毒(West Nile virus)屬于黃病毒科黃病毒屬,該病毒感染人類可導(dǎo)致西尼羅熱、西尼羅腦炎、腦膜炎等嚴(yán)重疾病。自1999年首次在美國紐約暴發(fā)流行后,西尼羅病毒在北美地區(qū)迅速蔓延,每年可導(dǎo)致3000多人患病,上百人死亡。尤其是最近幾年,在全球變暖和國際交流日益頻繁的大環(huán)境下,西尼羅病毒感染已經(jīng)成為全球公共衛(wèi)生的重要威脅。目前尚無安全有效的人用西尼羅病毒疫苗。DNA疫苗是一種新型的疫苗形式�；趶�(fù)制子技術(shù)的DNA疫苗有望成為西尼羅病毒疫苗研究的重要工具。 復(fù)制子(replicon)作為能自主復(fù)制的病毒亞基因組,是研究病毒復(fù)制機(jī)制及疫苗研發(fā)的理想工具。它具有病毒基因組的復(fù)制活性,但無法表達(dá)病毒結(jié)構(gòu)蛋白,在細(xì)胞中不能產(chǎn)生有感染性的病毒顆粒,具有良好的安全性。復(fù)制子具有兩種傳遞形式:DNA形式和RNA形式。近幾年報道的西尼羅病毒復(fù)制子大都是RNA形式,這種基于SP6或T7啟動子的復(fù)制子具有操作繁瑣和不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。而DNA形式的復(fù)制子基于CMV早期啟動子不需體外轉(zhuǎn)錄,可直接轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞,具有良好的應(yīng)用前景。另外,黃病毒復(fù)制子的免疫原性目前尚不明確。 為此,本研究首先在西尼羅病毒全長感染性克隆基礎(chǔ)上,利用反向遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建了一系列DNA形式的西尼羅病毒復(fù)制子,并通過表達(dá)報告基因?qū)?fù)制子活性進(jìn)行了檢測。然后將構(gòu)建的DNA形式的西尼羅病毒復(fù)制子免疫小鼠,分別從體液免疫和細(xì)胞免疫方面對復(fù)制子的免疫原性進(jìn)行了觀察。從而為西尼羅病毒DNA疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。 1.DNA形式的西尼羅病毒復(fù)制子的構(gòu)建與鑒定 為了構(gòu)建DNA形式的西尼羅病毒復(fù)制子,選用具有CMV啟動子的pWNIIrep-REN-IB質(zhì)粒載體作為復(fù)制子載體,首先將西尼羅病毒cDNA的3’半分子(NS1-3’UTR)連入該載體,再通過融合PCR等方法對連入的西尼羅病毒半分子的上游和下游序列分別進(jìn)行了改造。為了保證復(fù)制子具有復(fù)制活性,保留了病毒基因組的非編碼區(qū),編碼C蛋白N端99個氨基酸和E蛋白C端26個氨基酸的結(jié)構(gòu)蛋白基因及全部非結(jié)構(gòu)基因。同時,在西尼羅病毒3’半分子的下游引入了丁型肝炎病毒的核酶(HDVr)及猴病毒40 (SV40)的多聚腺甘酸序列。最終獲得了西尼羅病毒復(fù)制子pWNrep,經(jīng)DNA酶切和測序證實(shí)無誤。在此基礎(chǔ)上,分別把eGFP和Rluc報告基因插入到復(fù)制子pWNrep結(jié)構(gòu)基因缺失區(qū),采用雙順反子策略獲得了兩個含有不同報告基因的西尼羅病毒復(fù)制子pWNrep/eGFP和pWNrep/Rluc。同時,構(gòu)建了pWNrep/Rluc相應(yīng)的復(fù)制缺陷對照pWNrep/Rluc△NS5。 為進(jìn)一步在細(xì)胞中評價上述復(fù)制子的復(fù)制能力,分別將構(gòu)建的復(fù)制子轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞,結(jié)果在pWNrep/eGFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中可觀察到特異的GFP表達(dá),并能夠持續(xù)至轉(zhuǎn)染后60 h;而轉(zhuǎn)染pWNrep/Rluc和pWNrep/Rluc△NS5復(fù)制子后,對細(xì)胞裂解物的熒光素酶活性進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示, pWNrep/Rluc轉(zhuǎn)染后24h,Rluc活性達(dá)到第一個峰值,從36h到60h,Rluc活性持續(xù)升高。而缺失了病毒復(fù)制酶(NS5)基因的pWNrep/Rluc△NS5對照組的Rluc活性迅速降低。進(jìn)一步通過RT-PCR檢測表達(dá)Rluc細(xì)胞中的復(fù)制子RNA,結(jié)果表明,只有pWNrep/Rluc樣品中能檢測出西尼羅病毒3’UTR特異片段。這些結(jié)果說明,DNA形式的西尼羅病毒復(fù)制子能夠表達(dá)外源基因,具有良好的復(fù)制活性,為下一步觀察該復(fù)制子的免疫原性奠定了基礎(chǔ)。 2.DNA形式的西尼羅病毒復(fù)制子的免疫原性觀察 我們用復(fù)制子pWNrep質(zhì)粒通過肌肉注射途徑免疫4周齡的BAL B/c雌性小鼠,每2周免疫1次,共免疫3次�？蛰d體pVec和PBS(100μl/只)作為對照。首先采用間接免疫熒光法檢測小鼠血清中IgG抗體水平,結(jié)果表明,免疫三次后,pWNrep復(fù)制子DNA免疫組可檢測到特異識別西尼羅病毒NS1蛋白的IgG抗體,血清效價達(dá)1:160,而對照組均未檢測到相應(yīng)抗體的存在。同時,采用蝕斑減少中和試驗(yàn)檢測了小鼠血清中針對西尼羅病毒的中和抗體水平。結(jié)果顯示,隨著免疫次數(shù)的增加,復(fù)制子免疫組的血清中和效價呈現(xiàn)一個動態(tài)增長的過程,初次免疫后第1周,血清效價為1:19,而初次免疫后第5周,效價達(dá)到1:47。初次免疫后第13周中和效價達(dá)1:55,而對照組均未檢測到中和抗體。結(jié)果表明:DNA形式的西尼羅病毒復(fù)制子能夠激活小鼠的體液免疫反應(yīng),誘導(dǎo)產(chǎn)生西尼羅病毒特異的中和抗體。我們進(jìn)一步通過脾細(xì)胞增殖和脾細(xì)胞IFN-γ實(shí)驗(yàn)分析了小鼠的細(xì)胞免疫水平。結(jié)果顯示,經(jīng)西尼羅病毒NS1抗原刺激后,復(fù)制子pWNrep DNA免疫組脾細(xì)胞增殖活性明顯增加,刺激指數(shù)(SI)達(dá)到(8.9±0.7)約為空載體對照組的3倍,為PBS對照組的4倍,具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.01)。其分泌的IFN-γ水平為(99.0±18.8)pg/ml也顯著高于對照組(p0.05)。由此表明,DNA形式的西尼羅病毒復(fù)制子能在小鼠體內(nèi)激活T細(xì)胞記憶性免疫應(yīng)答和細(xì)胞因子釋放通路,誘導(dǎo)高水平的T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。 總之,本研究成功構(gòu)建了DNA形式的西尼羅病毒復(fù)制子,該復(fù)制子不僅具有良好的復(fù)制活性,而且在小鼠模型中能夠誘導(dǎo)有效的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)。該研究為西尼羅病毒DNA疫苗的研發(fā)提供了新的策略,也為其他蚊媒黃病毒復(fù)制子研究提供了新的方法。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R373

【參考文獻(xiàn)】

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1 于學(xué)東;秦成峰;姜濤;陳水平;鄧永強(qiáng);劉然;趙慧;李曉峰;朱武洋;于曼;秦鄂德;;含有海腎螢光素酶報告基因的登革4型病毒亞基因組復(fù)制子的構(gòu)建[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2008年02期

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本文編號：1449588