本文關(guān)鍵詞： 血小板源性生長因子 香煙煙霧 肺動脈 平滑肌 血管 肺血管重塑 香煙煙霧 血小板源性生長因子 肺動脈 平滑肌 細胞增殖 香煙煙霧 血小板源性生長因子 蛋白激酶C 肺動脈平滑肌　出處：《山西醫(yī)科大學》2012年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一部分煙霧暴露大鼠肺血管血小板源性生長因子的表達及其與肺血管重塑的關(guān)系 目的 觀察煙霧暴露大鼠肺動脈形態(tài)學變化、壓力變化及血小板源性生長因子(PDGFB/PD GFR-p)表達變化,探討煙霧暴露致大鼠肺血管重塑中PDGFB/PDGFR-β的表達變化及其意義。 方法 40只雄性SD大鼠隨機分為對照組(C組)、煙霧暴露1月組(S1m)、煙霧暴露2月組(S2m)、煙霧暴露3月組(S3m),建立煙霧暴露大鼠模型,檢測各組大鼠動脈血氧分壓(Pa02)、平均右心室收縮壓(mRVSP)、右心室肥厚指數(shù)(RVHI),HE染色觀察肺動脈組織學改變并測量肺小動脈管壁面積/管總面積(WA%),Masson染色檢測肺動脈壁膠原增殖,透射電鏡觀察肺小動脈的超微結(jié)構(gòu),免疫組織化學染色法觀察肺動脈平滑肌肌動蛋白(a-SMA)的表達,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR). Western-blotting檢測肺動脈PDGFB/PDGFR-β mRNA及蛋白的表達。 結(jié)果 1.C組、S1m、S2m及S3m組PaO2值分別為(96.2±4.3)、(92.1±5.2)、(90.5±4.1)及(89.6±4.8) mmHg,各組間比較,差異均無統(tǒng)計學意義(均P0.05)。 2.S3m組mRVSP及RVHI值為(65.63±5.6,54.79+7.13)與C組(14.07±4.18,32.41±0.26)比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)；S1m組(16.85±1.26,36.62±1.321、S2m組(23.57±4.51,40.23±2.12)與C組比較,差異均無統(tǒng)計學意義(均P0.05)。 3.C組、S1m、S2m及S3m組WA%值分別為(31.29±1.95)%、(42.68±2.24)%、(51.844±2.38)%、(62.11±1.39)%,隨煙霧暴露時間延長,WA%呈時間依賴性增加,與C組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.01)；煙霧暴露各組間比較,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.01)。 4.C組、S1m、S2m及S3m組肺動脈管壁膠原厚度分別為(4.67±0.36)μm、(8.96±1.80)μm、(11.8±2.12)μm、(15.3±1.65)μm。隨煙霧暴露時間延長,肺動脈管壁膠原沉積呈時間依賴性增加,與C組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.01)；煙霧暴露各組間比較,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.01)。 5.肺小動脈超微結(jié)構(gòu)觀察：C組內(nèi)皮細胞形態(tài)正常,胞外未見膠原纖維增生,平滑肌細胞未見增生。S1m組肺小動脈內(nèi)皮細胞形狀不規(guī)則,內(nèi)膜增厚,細胞內(nèi)可見線粒體腫脹,平滑肌細胞輕度增生。S2m組內(nèi)彈力膜厚薄不均,平滑肌走向不規(guī)則,膠原纖維增生。S3m組肺小動脈結(jié)構(gòu)層次紊亂,內(nèi)皮細胞變形嚴重,膠原纖維大量增生。 6.C組、S1m、S2m及S3m組肺動脈α-SMA表達量分別為(37.5±7.5)、(52.6±14.3)、(72.2±13.6)、(98.1±15.6),隨煙霧暴露時間延長,肺動脈α-SMA表達量呈時間依賴性增加,與C組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.01)；煙霧暴露各組間比較,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.01)。 7.肺動脈PDGFB/PDGFR-β mRNA和蛋白表達的比較 (1)C組、S1m、S2m及S3m組肺動脈PDGFB mRNA表達量分別為(0.31±0.09)、(0.35±0.02)、(0.42±0.01)、(0.55±0.03),隨煙霧暴露時間延長,肺動脈PDGFB mRNA表達量逐漸增加。煙霧暴露各組與C組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.01)。 (2)C組、S1m、S2m及S3m組肺動脈PDGFB蛋白表達量分別為(1.38+0.04)、(1.50±0.02)、(1.58±0.06)、(1.44±0.02)；隨煙霧暴露時間延長,PDGFB蛋白表達量增加。煙霧暴露各組與C組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.01)。 (3)C組、S1m、S2m及S3m組肺動脈PDGFR-β mRNA表達量分別為(0.21±0.09)、(0.41±0.02)、(0.61±0.03)、(0.83±0.08)；隨煙霧暴露時間延長,PDGFR-β mRNA表達量逐漸增加。煙霧暴露各組與C組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.01)。 (4)C組、S1m、S2m及S3m組肺動脈PDGFR-β蛋白表達量分別為(1.23±0.01)、(1.50+0.01)、(1.38±0.02)、(1.57±0.04)；隨煙霧暴露時間延長,PDGFR-β蛋白表達量增加。煙霧暴露各組與C組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.01)。 8.相關(guān)性分析mRVSP與RVHI成正相關(guān)(r=0.713,P0.05)；PDGFB mRNA及蛋白表達量與WA%均呈止相關(guān)(分別為r=0.941,r=0.605,均P0.05)；PDGFR-β mRNA及蛋白表達量與WA%均呈正相關(guān)(分別為r=0.936,r=0.820,均P0.05)；PDGFB與PDGFR-β mRNA表達量呈正相關(guān)(r=0.921,P0.05)；PDGFB與PDGFR-β蛋白表達無相關(guān)性(r=0.379,P0.05)。 結(jié)論 1.煙霧暴露可使肺血管形態(tài)發(fā)生明顯改變,肺小動脈超微結(jié)構(gòu)異常,導致肺血管重塑,肺血流阻力增加,右心室收縮壓升高。 2.煙霧暴露上調(diào)大鼠肺動脈PDGFB/PDGFR-β表達,PDGFB/PDGFR-β在肺血管重塑、肺動脈高壓形成過程中起重要作用。 第二部分血小板源性生長因子在香煙煙霧提取物介導的肺動脈平滑肌細胞增殖中的表達變化 目的 探討香煙煙霧提取物(CSE)對大鼠肺動脈平滑肌細胞(rPASMCs)增殖的影響及血小板源性生長因子(PDGFB/PDGFR-β)在其中的作用。 方法 1.培養(yǎng)rPASMCs,不同濃度CSE(0,2.5%,5%,10%,20%)作用于rPASMCs24小時,四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測rPASMCs增殖,流式細胞術(shù)觀察細胞周期變化。 2.不同濃度CSE(0,2.5%,5%,10%,20%)作用于rPASMCs24小時,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)和Western-blotting分別檢測PDGFB/PDGFR-β mRNA和蛋白表達。 3. rPASMCs與不同濃度PDGFR阻斷劑伊馬替尼(Imatinib)(1μM/L,2μM/L,4μM/L,8μM/L)預孵育1小時,然后暴露于10%CSE24小時,MTT法觀察細胞增殖的變化。 4. rPASMCs與PDGFR阻斷劑伊馬替尼(Imatinib)8μM預孵育1小時,然后暴露于10%CSE24小時,Western-blotting檢測PDGFB/PDGFR-β蛋白表達。 結(jié)果 1.CSE各組(2.5%,5%,10%,20%)rPASMCs MTT吸光度(A)值分別為(1.839±0.128)、(2.241±0.182)、(2.951±0.072)、(4.329±0.176),與對照組(0.977±0.156)比較明顯升高,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.01)。CSE各組(2.5%,5%,10%,20%)rPASMCs S期細胞百分數(shù)分別為(17.08±0.31)、(18.47±0.21)、(23.19±0.16)、(23.71±0.29),與對照組(13.04±2.39)比較明顯升高,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.01)。CSE各組(2.5%,5%,10%,20%)rPASMCsG2期細胞百分數(shù)分別為(45.21±5.20)、(47.05±14.14)、(42.05±8.97)、(41.15±6.80),與對照組(22.77±3.04)比較明顯升高,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.01)。 2.CSE各組(2.5%,5%,10%,20%)PDGFB mRNA表達量分別為(0.647±0.035)、(0.819±0.065)、(0.776±0.046)、(0.623±0.048),與對照組(0.411±0.026)比較,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.05)；CSE各組PDGFR-β mRNA表達量分別為(0.393±0.021)、(0.739±0.034)、(0.745±0.032)、(0.620±0.019),與對照組(0.411±0.011)比較,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.05)；CSE各組(2.5%,5%,10%,20%)PDGFB蛋白表達量分別為(0.367±0.015)、(0.716±0.033)、(0.897±0.041)、(1.202±0.039),與對照組(0.544±0.025)比較,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.05)；PDGFR-β蛋白表達量分別為(0.718±0.019)、(0.920±0.039)、(0.998±0.081)、(1.061±0.057),與對照組(0.585±0.026)比較,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。 3.10%CSE組MTT(A)值(2.643±0.099)增高,與對照組(0.856±0.017)比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)；10%CSE+Imatinib各組(1μtM/L,21μM/L,41μM/L,8μM/L)(A)值均降低,分別為(2.012±0.391)、(1.997±0.379)、(1.458±0.495)、(1.022±0.102),與10%CSE組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.01)。 4.10%CSE處理后,rPASMCs中PDGFB蛋白表達量升高(1.662±0.271),與對照組(0.996±0.181)比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)；伊馬替尼(Imatinib)十預后PDGFB蛋白表達量降低(1.231±0.192),與10%CSE組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)；10%CSE處理后,rPASMCs中PDGFR-β蛋白表達量升高(1.581±0.153),與對照組(0.986±0.131)比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)；伊馬替尼(Imatinib)干預后PDGFR-β蛋白表達量降低(1.211±0.192),與10%CSE組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 結(jié)論 1.CSE可誘導rPASMCs增殖。 2.CSE可使rPASMCs周期發(fā)生變化,細胞由G1期向S期和G2期轉(zhuǎn)換,促進細胞DNA復制和有絲分裂。 3.CSE誘導PDGFB/PDGFR-p mRNA和蛋白表達上調(diào)。 4.CSE誘導PDGFB及PDGFR-β表達上調(diào),二者存在相關(guān)關(guān)系。可能與PDGF信號通路配體PDGFB與受體PDGFR-β相互作用有關(guān)。 5. PDGFR阻斷劑可抑制CSE誘導的rPASMCs增殖效應且對PDGFB/PDGFR-β表達上調(diào)有明顯的抑制效應,其機制有待進一步研究。 第三部分蛋白激酶C-δ途徑促進大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖的機制研究 目的 探討蛋白激酶C-δ(PKC-δ)在香煙煙霧提取物(CSE)對大鼠肺動脈平滑肌細胞(rPASMCs)增殖中的影響及其對PDGFB/PDGFR-β表達的作用。 方法 1.培養(yǎng)rPASMCs細胞,rPASMCs與不同濃度的PKC-δ阻斷劑Rottlerin(1nM/L,2nM/L,4nM/L,8nM/L)預孵育1小時,然后暴露于10%CSE24小時,MTT法觀察細胞增殖的變化。 2. rPASMCs與Rottlerin8nM/L預孵育1小時,然后暴露于10%CSE24小時,流式細胞術(shù)觀察細胞周期的變化。 3. rPASMCs與不同濃度的PKC-δ阻斷劑Rottlerin (1nM/L,2nM/L,4nM/L,8nM/L)預孵育1小時,然后暴露于10%CSE24小時,采用RT-PCR、Western-blotting方法分別檢測PKC-δ mRNA和蛋白及pi-PKC-δ蛋白的表達。 4. rPASMCs與不同濃度的PKC-δ阻斷劑Rottlerin(1nM/L,2nM/L,4nM/L,8nM/L)預孵育1小時,然后暴露于10%CSE24小時,采用RT-PCR、Western-blotting方法分別檢測PDGFB/PDGFR-p mRNA和蛋白的表達。 結(jié)果 1.10%CSE組rPASMCs的MTT(A)值(3.535+0.353)增高,與對照組(0.873±0.184)比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。10%CSE+Rottlerin各組(1nM/L,2nM/L,4nM/L,8nM/L)A值均降低,分別為(2.322±0.358)、(2.227±0.291)、(1.903±0.212)、(0.944±0.109),與10%CSE組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.01)。 2.10%CSE組rPASMCs的S期細胞百分數(shù)(22.39±1.09)增高,與對照組(6.51±1.23)比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。10%CSE+Rottlerin8nM/L組S期細胞百分數(shù)降低為(12.21±1.96),與10%CSE組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。10%CSE組rPASMCs的G2期細胞百分數(shù)(17.12±0.45)增高,與對照組(4.03±2.96)比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。10%CSE+Rottlerin8nM/L組G2期細胞百分數(shù)降低為(8.59±2.05),與10%CSE組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。 3.各組PKC-δ mRNA和蛋白表達變化 (1)各組PKC-δ mRNA和蛋白表達量：對照組為(0.955±0.049,0.758±0.131),10%CSE組為(1.068+0.079,0.873±0.011),10%CSE+Rottlerin各組(1nM/L,2nM/L,4nM/L,8nM/L)分別為(1.027±0.113,0.813±0.174)、(0.971±0.118,0.723+0.117)、(0.851±0.065,0.904±0.011)、(0.887±0.053,0.881±0.025),各組比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 (2)各組pi-PKC-δ蛋白表達量：10%CSE組(1.485±0.058)增高,與對照組(0.985±0.009)比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。10%CSE+Rottlerin各組(1nM/L,2nM/L,4nM/L,8nM/L)pi-PKC-δ蛋白表達量下降,分別為(1.257±0.050)、(1.146±0.174)、(1.051±0.019)、(1.006±0.018),與10%CSE組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。 4. Rottlerin阻斷后各組PDGFB/PDGFR-β表達 (1)各組PDGFB mRNA表達：10%CSE組(1.245±0.020)增高,與對照組(0.649±0.046)比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。10%CSE+Rottlerin各組(1nM/L,2nM/L,4nM/L,8nM/L)PDGFB mRNA表達降低,分別為(1.235±0.086)、(0.722±0.035)、(0.679±0.023)、(0.676±0.035),與10%CSE組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。 (2)各組PDGFB蛋白表達：10%CSE組(1.746±0.132)增高,與對照組(0.654±0.009)比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。10%CSE+Rottlerin各組(1nM/L,2nM/L,4nM/L,8nM/L)PDGFB蛋白表達降低,分別為(1.322±0.066)、(0.913±0.020)、(0.932±0.219)、(0.918+0.013),與10%CSE組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。 (3)各組PDGFR-β mRNA表達：10%CSE組(1.728±0.029)增高,與對照組(0.973±0.069)比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。10%CSE+Rottlerin各組(1nM/L,2nM/L,4nM/L,8nM/L)PDGFR-β mRNA表達降低,分別為(1.225±0.056)、(1.021±0.074)、(0.935±0.051)、(0.745±0.074),與10%CSE組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。 (4)各組PDGFR-β蛋白表達：10%CSE組(1.207±0.058)增高,與對照組(0.657±0.009)比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。10%CSE+Rottlerin各組,(1nM/L,2nM/L,4nM/L,8nM/L)PDGFR-β蛋白表達降低,分別為(1.176±0.050)、(0.848±0.174)、(0.843±0.019)、(0.838±0.018),與10%CSE組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。 結(jié)論 1.CSE對PKC-δ的mRNA和蛋白表達無明顯作用。 2.CSE上調(diào)磷酸化PKC-δ蛋白表達,PKC-δ阻斷劑Rottlerin對磷酸化PKC-δ蛋白表達上調(diào)有明顯的抑制作用。 3.PKC-δ阻斷劑Rottlerin可以抑制CSE誘導的rPASMCs細胞增殖效應。 4.PKC-δ阻斷劑Rottlerin可以抑制CSE誘導的rPASMCs細胞周期變化。 5.PKC-δ阻斷劑Rottlerin對CSE誘導的PDGFB和PDGFR-β表達上調(diào)有明顯的抑制作用,CSE通過激活PKC-δ途徑促進rPASMCs細胞PDGFB/PDGFR-β的表達。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R363

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李豐,張燕,車東媛,鄧仲端;缺氧內(nèi)皮細胞介導肺動脈平滑肌細胞血小板源性生長因子mRNA表達[J];中華病理學雜志;1998年06期

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本文編號：1444796