本文關鍵詞： 許旺細胞 生物力學 骨延長術 周圍神經(jīng) 細胞增殖 基因表達譜　出處：《天津醫(yī)科大學》2012年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的：通過體外構建許旺細胞循環(huán)牽張力學模型,對體外培養(yǎng)的許旺細胞實施循環(huán)牽張應力刺激模擬載體神經(jīng)的緩慢牽張,探索循環(huán)牽張應變刺激對周圍神經(jīng)來源許旺細胞增殖以及mRNA表達的影響,從細胞生物力學以及分子生物學角度探討肢體延長中的神經(jīng)生長延長機制。 方法： 1.體外平面循環(huán)牽張應力加載模型的建立：將硅橡膠材料制作成0.1cm厚的透明薄膜,結合硅橡膠材料的泊松比以及彈性模量,應用三維有限元分析軟件對數(shù)據(jù)進行處理,模擬硅橡膠受到牽張應變后產(chǎn)生的形變；通過MTT方法比較細胞在硅橡膠和標準培養(yǎng)板上的生長情況,并采取體外皮下包埋實驗驗證硅橡膠材料是否具有生物學毒性。 2.許旺細胞的純化：分離新生6d的Wista大鼠雙側坐骨神經(jīng),雙酶消化法分離許旺細胞,用S-100免疫細胞化學染色方法對許旺細胞進行鑒定。將收集到的細胞分為3組,分別應用冷噴注法、改良冷噴注法和酶消化法對細胞進行純化,純化后的細胞分別計算純度,流式細胞儀測定細胞活性,并從細胞純度、細胞活性、純化后所得細胞數(shù)量三個方面對許旺細胞的純化方法進行評估,從而尋找最佳的許旺細胞純化方法。 3.循環(huán)牽張應變刺激加載：體外培養(yǎng)6d齡大鼠許旺細胞并傳至P3代,按照刺激強度分為0、5%和10%形變組,利用ElectroForce3200力學試驗儀搭載的BioDynamic生物反應艙系統(tǒng),以6h為固定時間點對細胞進行頻率為0.25Hz的周期性牽張應力刺激。觀察細胞形態(tài)學變化,流式細胞術檢測不同應力刺激下許旺細胞的增殖率,獲得許旺細胞增殖的最佳應力值,并分為無力學刺激組和力學刺激組2組。Trizol分別提取細胞mRNA,采用高通量技術分析實驗組與對照組細胞基因表達譜差異,并采用聚類分析、GO分析等對實驗結果進行分析整理。 結果： 1.本課題組自制的硅橡膠細胞載體表面應力分布均勻,有效應變面積分布大,生物學相容性尚可,在BioDynamic細胞應力加載系統(tǒng)的配合下,可滿足許旺細胞的牽張刺激的實驗。 2.相比冷噴注法和差速酶消化兩種方法而言,改良冷噴注法提純許旺細胞存在操作簡便,獲得許旺細胞純度高、不影響細胞活性等優(yōu)點,缺點是對操作者實驗操作技術和經(jīng)驗要求相對較高,初學者不易掌握,需在多次實踐中摸索掌握,但不失為一種可供參考的許旺細胞純化新方法,適合在本實驗中繼續(xù)使用。 3.在5%的應變刺激下,許旺細胞的S期細胞比例和增殖指數(shù)(PI)相比無應變刺激時有所升高,然而15%的應變刺激下,兩指標同時降低；光學顯微鏡下可見許旺細胞表現(xiàn)出明顯的形態(tài)學變化。比較實驗組與對照組基因表達譜,上調(diào)基因894個,下調(diào)基因1570個 結論：許旺細胞的增殖情況與所加載力的大小呈現(xiàn)一定的劑量相關性；適當大小的牽張應力通過某種機制作用于周圍神經(jīng)的許旺細胞并促進其增殖,同時,牽張應力可以改變許旺細胞多種基因的表達以及對許旺細胞的生命活動進行一系列的調(diào)控,這些基因有可能與軸突的生長存在密切的聯(lián)系。
[Abstract]:Objective: to construct the Schwann cell cycle stretch mechanical model in vitro of cultured Schwann cells circulating lead Zhang Yingli nerve stimulation carrier slow distraction, exploration of cyclic stretching stimulation on peripheral nerve derived Schwann cells proliferation and mRNA expression of the influence of nerve growth in limb lengthening extension mechanism from the perspective of molecular biology and cell biomechanics.
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本文編號：1443433