本文關鍵詞：Galectin-3調(diào)控Tip血管內(nèi)皮細胞塑管效應的機制研究　出處：《昆明醫(yī)科大學》2012年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：第一部分人外周血內(nèi)皮祖細胞及Tip血管內(nèi)皮細胞的分離培養(yǎng)與鑒定 目的：探討人外周血內(nèi)皮祖細胞的分離與培養(yǎng)方法,研究人外周血內(nèi)皮祖細胞的體外誘導培養(yǎng)條件及其生物學活性,擬證實人外周血是內(nèi)皮祖細胞除了骨髓以外的另一個理想來源。在一定的體外培養(yǎng)條件下,外周血內(nèi)皮祖細胞還可定向誘導分化為Tip血管內(nèi)皮細胞,不僅為下一步實驗研究提供所需的細胞來源,還為干細胞源性血管新生機制提供可靠的實驗室依據(jù)。 方法：采用Ficoll密度梯度離心法分離人外周血單個核細胞,將其接種在預先包被有人纖維連接蛋白的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。每日于倒置相差顯微鏡下觀察細胞的生長形態(tài)及內(nèi)皮祖細胞集落形成形態(tài),每隔3-4天換一次液,培養(yǎng)7天后收集貼壁細胞,根據(jù)內(nèi)皮祖細胞的特性,用流式細胞儀檢測內(nèi)皮祖細胞特異性抗原CD34、CD133及VEGFR等表面標志物,以鑒定培養(yǎng)后的細胞主要為內(nèi)皮祖細胞。培養(yǎng)至21天時倒置相差顯微鏡下觀察和鑒定Tip血管內(nèi)皮細胞形態(tài),并收集該貼壁細胞進行RT-PCR實驗檢測Tip血管內(nèi)皮細胞中vWF、eNOS等血管內(nèi)皮細胞系特異性基因的表達情況。 結(jié)果：分離獲得的單個核細胞培養(yǎng)4天后多數(shù)呈貼壁生長,7天后形成梭狀的內(nèi)皮樣細胞,部分細胞積聚成團形成克隆集落,流式細胞儀鑒定該細胞表達的內(nèi)皮祖細胞特異性抗原CD34、CD133及VEGFR分別為(68.9±2.34)%、(81.7±1.50)%、(97.1±2.01)%。繼續(xù)培養(yǎng)21天后的細胞呈鵝卵石樣改變,并伸出偽足相互連接形成類似血管腔樣結(jié)構,形態(tài)學表現(xiàn)為Tip血管內(nèi)皮細胞的形態(tài)特點,RT-PCR實驗檢測該細胞有血管內(nèi)皮細胞系特異性基因vWF、eNOS的表達。 結(jié)論：可以成功從人外周血中分離具有增殖分化潛能的內(nèi)皮祖細胞,該細胞可形成內(nèi)皮祖細胞特有的集落形成單位,并表達內(nèi)皮祖細胞的相對特異性抗原CD34、CD133及VEGFR。同時經(jīng)過特定的體外誘導培養(yǎng)體系可將其擴增并定向誘導分化為Tip血管內(nèi)皮細胞。 第二部分Galectin-3對外周血內(nèi)皮祖細胞源性Tip血管內(nèi)皮細胞增殖能力的影響 目的：內(nèi)皮祖細胞是血管內(nèi)皮細胞的前體細胞,是一群具有游走特性,在生理或病理因素的刺激下,可從骨髓動員到外周血,進一步增殖分化并參與受損血管的修復的幼稚內(nèi)皮細胞。半乳糖凝集素-3(Galectin-3)是一種半乳糖結(jié)合蛋白,該蛋白的糖結(jié)構識別域在血管生成的糖依賴過程中起著關鍵的作用。本實驗觀察Galectin-3對外周血內(nèi)皮祖細胞源性Tip血管內(nèi)皮細胞增殖能力的影響,為臨床干細胞治療慢性下肢動脈缺血性疾病提供新的實驗室依據(jù)。 方法：收集第一部分實驗中培養(yǎng)21天后的貼壁Tip血管內(nèi)皮細胞,隨機將Galectin-3分為終濃度各濃度組(共6組)：在外周血內(nèi)皮祖細胞源性Tip血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)液中分別加入終濃度為0ug/ml,0.1ug/ml,1.0ug/ml,2.5ug/ml,5.0ug/m1和10ug/ml的Galectin-3培養(yǎng)24小時。MTT比色法觀察不同濃度Galectin-3對外周血內(nèi)皮祖細胞源性Tip血管內(nèi)皮細胞增殖能力的影響。 結(jié)果：六組不同終濃度的Galectin-3對外周血內(nèi)皮祖細胞源性Tip血管內(nèi)皮細胞增殖能力的影響有差別(F值=37.329,P0.01)。加入Galectin-3的各濃度組外周血內(nèi)皮祖細胞源性Tip血管內(nèi)皮細胞的增殖能力均高于Oug/ml組,其中0.10ug/ml組,1.00ug/ml組及2.50ug/ml組與0ug/ml組比較無統(tǒng)計學意義(P0.05),但5.0ug/ml組及10.0ug/ml組明顯高于0ug/ml組,0.10ug/ml組,1.00ug/ml組及2.50ug/ml組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);10.0ug/ml濃度組也明顯高于5.0ug/ml濃度組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。外周血內(nèi)皮祖細胞源性Tip血管內(nèi)皮細胞增殖能力與Galectin-3濃度間存在正相關關系(r=0.966),兩變量有高度相關關系。 結(jié)論：Galectin-3可促進體外培養(yǎng)外周血內(nèi)皮祖細胞源性Tip血管內(nèi)皮細胞的增殖能力,是Tip血管內(nèi)皮細胞塑管效應過程中重要的因子之一。
[Abstract]:Isolation , culture and identification of endothelial progenitor cells and vascular endothelial cells from human peripheral blood in the first part Objective : To study the isolation and culture of endothelial progenitor cells from human peripheral blood . It is suggested that human peripheral blood endothelial progenitor cells can induce differentiation into the endothelial progenitor cells in vitro . Methods : Human peripheral blood mononuclear cells were isolated by Ficoll density gradient centrifugation . The growth morphology of endothelial progenitor cells and the formation of endothelial progenitor cells were observed under reversed phase contrast microscope . The surface markers of endothelial progenitor cells specific antigen CD34 , CD133 and VEGFR were detected by flow cytometry after 7 days . Results : After 4 days after the single core cell culture was isolated , most of the cells were adherent . After 7 days , spindle - shaped endothelium - like cells were formed . The specific antigens CD34 , CD133 and VEGFR were ( 68.9 鹵 2.34 ) % , ( 81.7 鹵 1.50 ) % and ( 97.1 鹵 0.01 ) % respectively . Conclusion : Endothelial progenitor cells with proliferative differentiation potential can be isolated from human peripheral blood successfully , which can form a specific colony forming unit of endothelial progenitor cells and express the relative specific antigens CD34 , CD133 and VEGFR of endothelial progenitor cells . Effect of the second part galectin - 3 on the proliferation of endothelial progenitor cells in peripheral vascular endothelial cells Objective : To investigate the effect of Galectin - 3 on the proliferation of vascular endothelial cells derived from vascular endothelial progenitor cells and to provide a new experimental basis for the treatment of chronic lower extremity arterial ischemic diseases by Galectin - 3 . Galectin - 3 is a kind of galactose binding protein . Methods : Galectin - 3 was randomly divided into final concentration groups ( group 6 ) . Galectin - 3 was cultured for 24 hours in the culture solution of peripheral vascular endothelial progenitor cells . The effects of Galectin - 3 on the proliferation of endothelial progenitor cells in peripheral blood were observed by MTT colorimetric method . Results : The effects of Galectin - 3 at different final concentrations on proliferation of endothelial progenitor cells in peripheral blood were different ( F = 37.329 , P0.01 ) . The proliferative capacity of endothelial progenitor cells in peripheral vascular endothelial cells was higher than that in Oug / ml group ( P0.05 ) . Conclusion : Galectin - 3 can promote the proliferation of endothelial progenitor cells derived from endothelial progenitor cells in vitro , which is one of the most important factors in the plastic tube effect of endothelial cells .

【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R329

【參考文獻】

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1 楊鏞;陸平;何曉明;楊國凱;羅開元;段志泉;時德;;人自體干細胞移植在重癥肢體缺血血流重建中的療效與評價[J];中國普外基礎與臨床雜志;2009年02期

2 楊國凱;楊鏞;何曉明;羅開元;萬嘉;楊光;李國劍;馬震寰;陸平;;外周血干細胞移植治療血栓閉塞性脈管炎[J];中國微創(chuàng)外科雜志;2009年09期

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本文編號：1412548