本文關鍵詞：脫細胞骨基質(zhì)聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞修復動物骨缺損實驗研究　出處：《延邊大學》2011年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：根據(jù)統(tǒng)計,在中國每年大約有一千三百二十萬人次發(fā)生骨折,其中有10-15%無法愈合,另外,每年因為做關節(jié)置換手術、外傷、骨骼發(fā)育異常,或是其它原因造成的骨科手術高達一百萬例,而在這一百萬個手術中,約有四十五萬個手術是需要接受骨移植的。然而,骨移植的材料來源不論在數(shù)量上或是在質(zhì)量上,卻是明顯不足的。骨科醫(yī)師在臨床上,經(jīng)常碰到的問題,就是骨折的處理,一般人發(fā)生骨折之后,只要有適當?shù)奶幚?大多會如期愈合。在正常愈合所需的時間過后,如果尚未愈合,就是延遲愈合。其原因包括骨折碎片間的間隙過大,固定不可靠,骨折碎片的血液供應不足,開放性骨折合并廣泛軟組織損傷及感染等等。傳統(tǒng)上是解除原因,延長愈合時間持續(xù)治療,但仍然不愈合,就是骨折不愈合。治療骨折不愈合可用物理性刺激,或是使用骨移植手術的方法。臨床上,通常骨移植物來源于自體骨移植：即”取”患者自己身上的骨來”種”到需要的部位,如：髂骨、腓骨或肋骨取下的骨頭,移植到需要的部位。一般來說,自體骨移植塊的效用最佳,且不會發(fā)生疾病傳播及排斥反應問題,但由于數(shù)量有限,且未能提供夠強的大塊骨移植塊,因此應用范圍會受限。而異體骨移植,即取自其它人捐贈骨骼進行骨移植,須經(jīng)過特殊處理(如低溫冰凍、冷凍干燥、輻射處理等),降低其抗原性,以減小排斥現(xiàn)象,并且確定無感染病原后才可使用。但是異體移植骨來源有限,價格昂貴,必須在無菌狀態(tài)下儲存,且保存日期有限,依保存方法而有差異。異體骨移植塊的缺點為可能傳播肝炎病毒及艾滋病病毒,值得注意。此外,大塊異體骨移植塊通常會發(fā)生骨移植塊與宿主骨骼間的融合延緩,以及骨移植塊發(fā)生吸收或疲乏性骨折等問題。因此,本文研究的重點在于同種異體移植,即將同種骨經(jīng)過Triton X-100處理后,去除主要的抗原成分,留下礦物質(zhì)及部分有機成分,作為骨移植塊使用。Meezan首先使用化學除垢劑制作了無細胞基底膜,Wilson又首先以Triton X-100為主脫去組織中的所有細胞、抗原、脂質(zhì)、可溶性蛋白質(zhì)和可溶性糖胺多糖等物質(zhì)。其中他采用的除垢劑酶消化方法對狗頸總動脈行脫細胞處理,組織學及電鏡觀察無細胞成分存在,在基質(zhì)中主要為膠原和彈性蛋白,結構保存良好。美國Lifecell公司用同樣方法制作真皮基質(zhì)獲得了商業(yè)性的成功。Dahms對處理的膀胱脫細胞基質(zhì)成分分析表明了其主要成分為Ⅰ型、Ⅲ型膠原和彈性蛋白。因此,就目前所用的脫細胞處理的方法而言,其基本上保留了促進細胞增殖生長的生物活性成分,為其植入體內(nèi)修復及再生損傷或缺損的組織提供了物質(zhì)基礎。這樣我們有理由相信采用同樣方法制備的脫細胞骨基質(zhì)能夠提供漸進式替換作用的骨架,加上自體骨髓間充質(zhì)干細胞的作用,在體外聯(lián)合培養(yǎng)后,最終能夠修復動物的骨缺損。 本研究的主要方法和結果： 1、脫細胞骨基質(zhì)的制備 實驗聯(lián)合應用過氧化氫、低滲Tris-Hcl和TritonX-100制備了脫細胞骨基質(zhì),之后通過HE染色見新鮮的大鼠松質(zhì)骨組織切片中可見骨陷窩中含有大量細胞結構,膠原纖維排列整齊；處理組骨陷窩、骨小管中尚有嗜酸性物質(zhì)殘留；處理組標本可見細胞成分基本消失,骨陷窩、骨小管空虛,膠原纖維排列整齊。甲苯胺藍染色見正常骨松質(zhì)的骨小梁膠原纖維排列成行,骨細胞占據(jù)的骨陷窩分布在骨小梁。骨陷窩中骨細胞核清晰可見,大多數(shù)骨陷窩內(nèi)只有一個骨細胞核。脫細胞骨的細胞外基質(zhì)膠原纖維排列整齊,染色呈不同程度藍色,橢圓形骨陷窩內(nèi)空虛,無骨細胞核及其他結構。 2、免疫組化染色 免疫組化染色見實驗組支架材料的纖維連接蛋白和層粘連蛋白的染色陽性部位在BAECM的骨陷窩周邊部,染色較深,呈篩網(wǎng)狀、線狀分布,為清晰棕色。 3、掃描電鏡觀察 掃描電鏡可見骨支架是由大量片狀骨小梁連接而成的多孔網(wǎng)架,形似海綿狀。骨小梁之間的孔隙直徑在200-400μm之間,孔間隔厚度為60-100μm。孔隙率為60%,孔洞之間有連聯(lián)。處理后的骨支架的孔隙內(nèi)已無骨髓成分。掃描電鏡下可見骨小梁上的許多平行排列的骨陷窩,且骨陷窩內(nèi)已無細胞成分。 4、透射電鏡觀察 透射電鏡可見脫細胞骨基質(zhì)的骨陷窩多為低密度影像,有多處空白區(qū),可見少量洗脫殘留物質(zhì)；對照新鮮骨基質(zhì)的骨陷窩中明顯含有細胞成分,并可見細胞核的核仁。免疫組織化學透射電鏡可見在脫細胞骨基質(zhì)的骨陷窩周邊彌散存在陽性標記電子密度較高的DAB反應產(chǎn)物呈團塊,網(wǎng)狀分布,基質(zhì)可見網(wǎng)狀纖維結構,膠原纖維排列整齊。 5、洗脫劑殘留量測定 洗脫劑TritonX-100殘留量測定見對照品出峰時間分別為2.495、4.008、4.009min,峰面積948825、1652336、1645545。樣品在3min左右無峰值出現(xiàn)。最低檢出極限為0.5μl/ml。 6、移植免疫分析 移植免疫分析在術后4、8周各植入處理組的血清中均可檢測出抗體,各時間處理檢測組與其相應的無關抗原對照組之間差異非常顯著(P0.01),說明抗體是針對SD大鼠骨抗原的特異性抗體。統(tǒng)計學分析表明：新鮮骨移植組血清抗體相對OD值最高,與脫細胞骨基質(zhì)差異非常顯著(P0.01)。淋巴細胞刺激實驗中經(jīng)兩種移植物第一次體內(nèi)致敏后,在體外用SD大鼠脾淋巴細胞二次刺激,新鮮骨移植組的淋巴細胞刺激指數(shù)最高,與脫細胞骨基質(zhì)移植組有顯著差異(P0.01),植入SD大鼠兩種移植物術后8周,再在體外給予相應移植物二次刺激組中,新鮮骨刺激淋巴細胞增殖,而脫細胞骨基質(zhì)表現(xiàn)為對淋巴細胞增殖的抑制(P0.01)。 7、骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng) 鏡下觀察見大鼠BMSCs的原代細胞剛接種時呈圓形,多數(shù)懸浮于培養(yǎng)液中,可見克隆形成。48h后大部分細胞都貼壁,換液除去未貼壁的細胞后,可見部分貼壁細胞形態(tài)不一,呈梭形的成纖維細胞樣或多角形改變,核較大,位于細胞中央或邊緣。3-4天開始出現(xiàn)散在的貼壁生長的成纖維樣的細胞,再過2-3天,細胞呈現(xiàn)克隆樣生長的集落,集落細胞增殖迅速,7天左右每個集落約含有100-200個細胞,細胞形態(tài)基本為紡錘形的成纖維細胞樣,部分呈寬大扁平的多邊形,約9-11天時融合成單層,一般能夠達到70%-80%的細胞融合狀態(tài)。 8、流式細胞儀鑒定 流式細胞儀檢測見培養(yǎng)的第3代BMSCs均一表達CD90、CD44、CD106,陽性率分別為90.05%、95.48%、67.22%;而CD34、CD45、CD11b陰性,陽性率分別為1.02%、0.86%、0.32%。 9、誘導后的細胞形態(tài)觀察 倒置顯微鏡下觀察可見多數(shù)細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,由梭形轉化為圓形或方形,且胞體增大,胞核變大變圓,胞漿中可見較多細小黑色顆粒,胞核色較淡,胞漿色較深,胞核與胞漿對比明顯。 10、誘導后的細胞鑒定 茜素紅染色見部分細胞成聚集生長,形成礦化結節(jié),茜素紅染色顯示為橘紅色；鈣鉆法堿性磷酸酶染色顯示胞漿中一些細小黑色顆粒為棕黑色；Ⅰ型膠原免疫熒光染色陽性,紅色熒光(Cy3)表示Ⅰ型膠原在細胞內(nèi)的分布,Ⅰ型膠原多在胞漿靠近胞核處,藍色熒光(DAPI)為細胞核。 11、掃描電鏡觀察聯(lián)合培養(yǎng)的脫細胞骨基質(zhì)與誘導后的成骨樣細胞 聯(lián)合培養(yǎng)24,48,72h后,掃描電鏡觀察并未見脫細胞骨基質(zhì)組和羥基磷灰石組之間的細胞形態(tài)有明顯差異,細胞在兩組材料上均生長良好,且分布均勻,細胞形態(tài)大小不一,但在兩組材料中均可見大量的球形細胞黏附在材料上面,每個細胞直徑在3-10μm之間,在個別部位還可見正在增殖中的細胞克隆,細胞生長狀態(tài)良好。 12、堿性磷酸酶檢測 隨著培養(yǎng)時間的延長,脫細胞骨基質(zhì)組和羥基磷灰石組的堿性磷酸酶表達活性都呈上升趨勢。在浸提液培養(yǎng)12h和24h,兩組之間差異無顯著性意義(P0.05)；在培養(yǎng)48h和72h,脫細胞骨基質(zhì)組和羥基磷灰石組之間差異有顯著性意義(P0.05)。 13、復合細胞的天然脫細胞骨支架修復骨缺損實驗 成功制作大鼠股骨骨缺損模型后,將復合有細胞的脫細胞骨基質(zhì)支架材料移植在缺損處,術后4周熒光顯微鏡見對照組羥基磷灰石支架在鏡下顯現(xiàn)為黑色條影,周邊可見發(fā)出綠色熒光的新生骨組織,實驗組天然脫細胞骨松質(zhì)已經(jīng)能夠非常完好地與周邊新生骨組織融合在一起,熒光顯微鏡下無法分辨出其間的差別。普通光鏡觀察見術后4周及8周的對照組羥基磷灰石顯示為黑色條帶陰影,而脫細胞骨基質(zhì)支架之間已填滿新生的骨組織,骨支架與新生骨組織很好的融合在一起。偶可見炎性細胞浸潤；術后8周甲苯胺藍染色可見對照組羥基磷灰石顯示為黑色條帶陰影,而對照組和實驗組的支架之間都可以見到已形成的骨單位,新生骨組織已經(jīng)比較成熟。 研究結論： 1、利用大鼠股骨成功制備了適于同種異體移植的組織工程骨基質(zhì)； 2、利用動物自身的骨髓間充質(zhì)干細胞成功地誘導為成骨樣細胞； 3、制備的脫細胞骨基質(zhì)在體外適于誘導而來的成骨樣細胞的生長； 4、聯(lián)合培養(yǎng)的有細胞的脫細胞骨基質(zhì)能夠很好地修復大鼠股骨骨缺損,有望應用于臨床骨缺損疾病的治療。
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【學位授予單位】：延邊大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R-332

【參考文獻】

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本文編號：1408021