本文關(guān)鍵詞：樹(shù)突狀細(xì)胞分化成熟的表觀遺傳組學(xué)研究　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2011年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 樹(shù)突狀細(xì)胞 表觀遺傳學(xué) 表觀基因組學(xué) DNA甲基化 組蛋白修飾 核定位小RNA 天然免疫

【摘要】：樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cell,DC)于1973年被Steiman和Cohn首次從脾臟中分離出來(lái),隨后的一系列研究發(fā)現(xiàn)其在免疫識(shí)別、免疫應(yīng)答和免疫調(diào)控中發(fā)揮著重要作用,因此,有關(guān)DC的免疫生物學(xué)基礎(chǔ)研究及其與臨床疾病發(fā)生發(fā)展和治療的應(yīng)用性研究是當(dāng)今免疫學(xué)領(lǐng)域的前沿?zé)狳c(diǎn)。DC來(lái)源于造血干細(xì)胞,其在免疫應(yīng)答的首要環(huán)節(jié)——抗原識(shí)別與提呈中扮演著重要的角色。免疫系統(tǒng)中的DC主要存在兩種功能狀態(tài):未成熟DC(immature DC,imDC)和成熟DC(mature DC, mDC),不同的成熟狀態(tài)決定了DC不同的功能特性,imDC具有很強(qiáng)的攝取和加工抗原的能力,并能夠通過(guò)其表面的趨化因子受體,通過(guò)血液和淋巴系統(tǒng)遷移入淋巴結(jié)和脾;imDC在攝取抗原和炎癥信號(hào)的刺激下轉(zhuǎn)變?yōu)閙DC,mDC抗原提呈能力明顯增強(qiáng),高表達(dá)共刺激分子和T細(xì)胞區(qū)的趨化因子受體,并分泌大量的細(xì)胞因子,激活T細(xì)胞,觸發(fā)T細(xì)胞的增殖和分化。同時(shí)其分泌的炎性細(xì)胞因子和趨化因子能夠吸引和活化天然免疫細(xì)胞以形成免疫應(yīng)答與調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)。DC作為免疫系統(tǒng)中功能最強(qiáng)大的專(zhuān)職抗原提呈細(xì)胞(Antigen-presenting cells, APC),是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁,有關(guān)DC分化發(fā)育、功能調(diào)控機(jī)制的研究仍然有問(wèn)題尚不明了,DC與疾病發(fā)生發(fā)展關(guān)系與治療的應(yīng)用研究也有待于進(jìn)一步深入探討與驗(yàn)證。 作為獨(dú)立于基因組序列本身,以整個(gè)染色質(zhì)組成及其動(dòng)態(tài)調(diào)控為研究對(duì)象的表觀遺傳學(xué)(Epigenetics)成為了21世紀(jì)極為重要的生命學(xué)科之一。經(jīng)歷從1842年至今的巨大發(fā)展,表觀遺傳學(xué)逐漸走向成熟,形成了以DNA甲基化、組蛋白修飾、能量依賴的染色質(zhì)重塑、核小體的動(dòng)態(tài)重組以及非編碼RNA研究為核心的主流生命科學(xué)學(xué)科。各種表觀遺傳學(xué)事件在不同層次的相互作用和整合,建立和維持了不同的基因表達(dá)模式,嚴(yán)格的控制著從受精卵到完整生命體的分化發(fā)育全過(guò)程,成熟體各種細(xì)胞表型的維持以及與外界環(huán)境相互作用所產(chǎn)生的應(yīng)答和反應(yīng),從而在機(jī)體的整個(gè)生理?xiàng)l件下發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用。在組學(xué)背景下,利用芯片以及第二代測(cè)序技術(shù),在全基因組水平系統(tǒng)全面的研究表觀遺傳修飾圖譜的表觀遺傳組學(xué)(Epigenome)也應(yīng)運(yùn)而生。系統(tǒng)、綜合地在全基因組水平上繪制細(xì)胞乃至各實(shí)體分化,發(fā)育的動(dòng)態(tài)DNA甲基化譜、組蛋白修飾譜、non-coding RNA組,已經(jīng)成為系統(tǒng)深入地研究生命發(fā)生本質(zhì)和疾病發(fā)生發(fā)展的重要手段。 近十年來(lái),免疫學(xué)研究的發(fā)展突飛猛進(jìn),基礎(chǔ)免疫學(xué)、臨床免疫學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)三大方面齊頭并進(jìn),同時(shí)免疫學(xué)與其他生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)學(xué)科的交叉更加深入和廣泛,在組學(xué)時(shí)代的宏觀背景下,免疫組學(xué)也逐漸形成。同時(shí)伴隨著功能基因組學(xué)時(shí)代的浪潮,免疫組學(xué)與各種組學(xué)研究也開(kāi)始相互融合,越來(lái)越多的免疫學(xué)家開(kāi)始把各種組學(xué)研究運(yùn)用到免疫模型中去解決免疫學(xué)的根本性科學(xué)問(wèn)題。表觀遺傳組學(xué)也開(kāi)始應(yīng)用到免疫細(xì)胞分化發(fā)育,以及免疫相關(guān)疾病和血液腫瘤的研究中。T細(xì)胞、B細(xì)胞的全基因組DNA甲基化譜已經(jīng)開(kāi)始利用低分辨率的技術(shù)手段進(jìn)行繪制,與此同時(shí),通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)合測(cè)序(ChIP-sequencing)繪制全基因組組蛋白修飾譜,也應(yīng)用到免疫學(xué)研究中,國(guó)外幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了CD4+T細(xì)胞分化過(guò)程中(naive, Th1, Th2,Th17, iTreg, and natural Treg (nTreg) cell)的組蛋白修飾譜研究,并結(jié)合基因表達(dá)譜來(lái)找尋組蛋白修飾在調(diào)控不同類(lèi)型基因中的共同規(guī)律。關(guān)于DC分化、成熟及其功能的表觀遺傳調(diào)控研究才起步,大多數(shù)研究尚集中在對(duì)一些DC的功能性細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)控,如組蛋白甲基化修飾對(duì)IL-12的調(diào)控,以及HDAC11對(duì)IL-10的負(fù)調(diào)控作用等等,同時(shí)抗原提呈關(guān)鍵分子MHC II類(lèi)分子及其調(diào)控因子CIITA在DC成熟和活化中也受到表觀因子的調(diào)控,但目前尚沒(méi)有從DC的分化和特異功能的角度來(lái)探討表觀修飾因子調(diào)控DC的標(biāo)志性研究。 表觀遺傳學(xué)通過(guò)對(duì)染色質(zhì)狀態(tài)的調(diào)控,控制著細(xì)胞特異性基因群體在特定的時(shí)間和空間的開(kāi)啟與關(guān)閉。特定的細(xì)胞群體,在外界信號(hào)的作用下,或者在分化發(fā)育過(guò)程中,建立起自身獨(dú)特性的DNA甲基化譜、組蛋白修飾譜以及非編碼RNA組,通過(guò)這些表觀調(diào)控因子在全基因組范圍內(nèi)的整合和相互作用,建立起組織和細(xì)胞特異性的表觀遺傳組,而反過(guò)來(lái)表觀遺傳組又能夠建立細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄組,從而使特定細(xì)胞群體獲得其特異的功能狀態(tài),從而建立了out-in-out的調(diào)控模式,決定了細(xì)胞的分化發(fā)育命運(yùn)。 從表觀遺傳學(xué)的觀點(diǎn),單一的細(xì)胞群體,特別是人的原代細(xì)胞的特異性表觀遺傳組圖譜,會(huì)具有怎樣的典型特征呢? DNA甲基化譜、組蛋白修飾組、非編碼RNA組以及染色質(zhì)重塑復(fù)合體,在人的原代細(xì)胞的分化發(fā)育過(guò)程中,又是如何相互作用和相互影響,在DNA、組蛋白以及與其相結(jié)合的RNA和蛋白質(zhì)的各個(gè)層次和三維空間中,建立起細(xì)胞特有的表觀遺傳組的呢? 從特定免疫細(xì)胞群體,如樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)等出發(fā),哺乳動(dòng)物,特別是人的血液系統(tǒng)和免疫器官中特定原代免疫細(xì)胞,在特定的信號(hào),如細(xì)胞因子作用和感染刺激的誘導(dǎo)下,是如何通過(guò)外界信號(hào)的傳遞,從胞外-胞膜-胞漿-胞核,由外而內(nèi)的傳遞DC分化成熟信號(hào),通過(guò)外界信號(hào)活化和誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子,非編碼RNA等建立起信號(hào)特異性的動(dòng)態(tài)的特征性表觀遺傳組?再?gòu)陌?胞漿-胞膜-胞外,由內(nèi)而外的,通過(guò)表觀遺傳因子的特異性調(diào)控,決定關(guān)鍵基因的開(kāi)啟與關(guān)閉,從而建立起未成熟DC(imDC)、成熟DC(mDC)的特異性功能特征,如抗原攝取、加工、提呈能力的差異性調(diào)控,DC特異性細(xì)胞因子和抗菌分子的分泌? 基于以上研究進(jìn)展和現(xiàn)狀分析,針對(duì)以上科學(xué)問(wèn)題的思考,我們利用深度測(cè)序技術(shù),以表觀遺傳組學(xué)為研究手段,深入研究了人單核細(xì)胞,以及由其體外分化而來(lái)的人未成熟DC與成熟DC的動(dòng)態(tài)的、以單個(gè)核苷酸為分辨率的全基因組DNA甲基化譜、組蛋白修飾譜、表達(dá)譜以及小RNA組,系統(tǒng)闡述了新鮮分離純化的人免疫細(xì)胞群體的特征性表觀遺傳組,以及各表觀調(diào)控因子之間的相互關(guān)系,并通過(guò)尋找DC分化成熟過(guò)程中的差異表觀修飾位點(diǎn),來(lái)進(jìn)一步揭示炎癥信號(hào)如何通過(guò)由外到內(nèi)的傳遞,特異性的介導(dǎo)表觀修飾的改變,而又通過(guò)這些表觀修飾來(lái)影響關(guān)鍵基因,如轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),從而使DC具備了其特異性的功能狀態(tài),由此建立了特異性信號(hào)誘導(dǎo)——差異表觀修飾位點(diǎn)——關(guān)鍵基因表達(dá)改變的研究思路,為尋找調(diào)控DC分化發(fā)育的關(guān)鍵分子,特別是核內(nèi)的調(diào)控因子奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 同時(shí),考慮到專(zhuān)職定位于核內(nèi)的小RNA的研究目前尚是空白,我們通過(guò)小鼠成熟DC(mDC)胞漿、胞核小RNA組的建立,從另一個(gè)表觀遺傳調(diào)控因子——非編碼小RNA的視角,來(lái)尋找和研究細(xì)胞核內(nèi)的調(diào)控性小RNA的分布和序列特征,并結(jié)合DC的功能特點(diǎn),初步探討了這些核內(nèi)小RNA是如何特異性地靶向關(guān)鍵基因的調(diào)控區(qū)域,來(lái)介導(dǎo)表觀修飾的改變,從而控制DC特異功能基因的開(kāi)啟和關(guān)閉的。 一.人單核細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞分化成熟的動(dòng)態(tài)表觀遺傳組學(xué)圖譜的建立和表觀調(diào)控機(jī)制的初步研究 為了應(yīng)用表觀遺傳組學(xué)的技術(shù)手段來(lái)分析人DC分化成熟的表觀調(diào)控機(jī)制,我們分離了單個(gè)正常人的CD14+單核細(xì)胞,并體外誘導(dǎo)分化為imDCs,并進(jìn)一步用LPS刺激imDCs,誘導(dǎo)其成為mDCs。提取這三種細(xì)胞的DNA、RNA以及以組蛋白修飾為研究對(duì)象,進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn),獲得ChIP-DNA,將所得產(chǎn)物進(jìn)行DNA甲基化譜測(cè)序、表達(dá)譜測(cè)序、小RNA組測(cè)序、ChIP-seq,建立了三種細(xì)胞的以單個(gè)核苷酸為分辨率的DNA甲基化譜、組蛋白修飾H3K4me3和H3K27me3的全基因組修飾譜、基因表達(dá)差異的表達(dá)譜、小RNA表達(dá)差異的小RNA組,將這些數(shù)據(jù)進(jìn)行整合研究,發(fā)現(xiàn)三種細(xì)胞中全基因組DNA甲基化主要以CG為背景的C的甲基化為主,占99%以上,同時(shí)三種細(xì)胞的甲基化率均一性較強(qiáng),80%以上的以CG為背景的甲基化的C(mCG)的甲基化率均在90%以上,同時(shí)在monocyte分化為imDC的過(guò)程中,發(fā)生了廣泛的DNA去甲基化。組蛋白修飾H3K4me3和H3K27me3在全基因組的分布分析顯示,二者在基因的CDS區(qū)較少富集,同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)H3K4me3和H3K27me3共修飾的區(qū)域其DNA甲基化率明顯低于H3K4me3和H3K27me3單獨(dú)富集的區(qū)域,在單核細(xì)胞中尤為明顯。這可能也反映了H3K4me3和H3K27me3共修飾的區(qū)域,通過(guò)DNA的低甲基化保持了可誘導(dǎo)活化或抑制的調(diào)控潛能。通過(guò)進(jìn)一步分析基因組各元件的DNA甲基化特征,我們發(fā)現(xiàn)CG的密度與甲基化率存在負(fù)相關(guān),CG高密度區(qū)的DNA甲基化率較低。同時(shí)不同的基因組元件也有其各自的DNA甲基化分布模式。 單細(xì)胞分析基因表達(dá)量與DNA甲基化和組蛋白修飾的關(guān)系,我們發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的基因其啟動(dòng)子區(qū)的DNA甲基化率較低,但在其轉(zhuǎn)錄區(qū),特別是第一個(gè)intron之后的轉(zhuǎn)錄區(qū),其DNA甲基化與基因表達(dá)是正相關(guān)的。而遠(yuǎn)端的啟動(dòng)子區(qū),也能觀察到DNA甲基化與表達(dá)量的正相關(guān)關(guān)系。而microRNA表達(dá)豐度與DNA甲基化的關(guān)系,卻有不同,microRNA轉(zhuǎn)錄區(qū)的DNA甲基化是明顯地高甲基化對(duì)應(yīng)低表達(dá),這說(shuō)明了microRNA和蛋白編碼基因的DNA甲基化調(diào)控模式是不同的。同時(shí)組蛋白修飾H3K4me3和H3K27me3主要集中在TSS附近,H3K4me3富集于高表達(dá)基因,而H3K27me3富集于低表達(dá)基因,說(shuō)明了二者對(duì)于基因表達(dá)的不同調(diào)控作用。 我們進(jìn)一步分析了基因表達(dá)和表觀修飾在三種細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)變化特征,基因表達(dá)的雷達(dá)圖分析表明,DC分化成熟時(shí),伴隨著廣泛的基因表達(dá)變化,說(shuō)明了三種細(xì)胞不同的功能狀態(tài),從蛋白編碼基因表達(dá)變化圖中可以看出,在monocyte-imDC-mDC分化成熟過(guò)程中,先升高后降低的變化基因較少,也說(shuō)明了DC和單核細(xì)胞在基因表達(dá)和功能上的異質(zhì)性。而microRNA的表達(dá)差異分析表明,表達(dá)量顯著降低的microRNA較多,也反映了單核細(xì)胞分化為DC的過(guò)程中,通過(guò)下調(diào)microRNA來(lái)解除對(duì)一些基因表達(dá)的抑制,從而獲得更多的功能。PCA分析表明,DNA甲基化相對(duì)于組蛋白修飾和microRNA,在三種細(xì)胞中是比較穩(wěn)定的。通過(guò)DC功能相關(guān)pathways的基因啟動(dòng)子區(qū)的DNA甲基化分析表明,這些pathways中大多數(shù)基因在單核細(xì)胞分化為imDC時(shí)發(fā)生了DNA的去甲基化,為這些基因的高表達(dá)或后期的激活做好準(zhǔn)備。通過(guò)DNA甲基化和組蛋白修飾以及microRNA的聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn),DNA甲基化和組蛋白H3K27me3的動(dòng)態(tài)變化呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì),特別是對(duì)于H3K27me3高富集的區(qū)域,說(shuō)明了二者的共調(diào)控關(guān)系。 DNA甲基化在單核細(xì)胞分化為imDC的過(guò)程中略微降低,但在imDC成熟時(shí),DNA甲基化從整體水平上看較為穩(wěn)定,那么DNA甲基化是如何參與調(diào)控DC成熟的呢?我們通過(guò)尋找imDC-mDC的差異甲基化區(qū)域(differential methylated regions, DMRs),發(fā)現(xiàn)DNA甲基化能夠調(diào)控一些轉(zhuǎn)錄因子。眾所周知,轉(zhuǎn)錄因子對(duì)于細(xì)胞的分化和功能狀態(tài)的調(diào)控是極其重要的。我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子FLI1、HSF4和EGR1啟動(dòng)子的特定區(qū)域,在DC成熟時(shí),經(jīng)歷了DNA甲基化水平的升高,而其表達(dá)卻顯著降低。我們進(jìn)而以EGR1為研究對(duì)象,探討了EGR1在DC分化成熟中的功能,通過(guò)EGR1的ChIP-seq數(shù)據(jù)分析,發(fā)現(xiàn)EGR1在imDC中傾向于調(diào)控細(xì)胞表面分子的表達(dá),通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的gain-and-loss研究,發(fā)現(xiàn)EGR1能夠抑制CD86,CD48,CD58的表達(dá),從而抑制DC的成熟,可見(jiàn),為了促進(jìn)CD86,CD48,CD58的表達(dá)而使DC更好地激活T細(xì)胞,促DC成熟信號(hào)可以通過(guò)調(diào)控DNA甲基化而抑制了EGR1的表達(dá),從而促進(jìn)了DC成熟及其T細(xì)胞激活功能。 二.小鼠成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(mDC)核內(nèi)小RNA組的建立、特征分析以及初步功能探討 隨著非編碼RNA研究的深入,非編碼小RNA的存在及功能越來(lái)越受到關(guān)注。siRNA作為植物中存在的內(nèi)源性小RNA,能夠以全序列匹配的方式介導(dǎo)靶mRNA的降解,microRNA作為一種更加廣泛存在于動(dòng)植物中的非編碼小RNA,以部分序列匹配的方式參與細(xì)胞內(nèi)mRNA的降解和翻譯的抑制。siRNA在植物中能夠介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄水平的表觀調(diào)控,如介導(dǎo)基因啟動(dòng)子區(qū)的DNA甲基化的修飾,但哺乳動(dòng)物中現(xiàn)今并沒(méi)有找到一類(lèi)介導(dǎo)表觀調(diào)控的小RNA,基于此,我們以小鼠mDC為細(xì)胞模型來(lái)尋找哺乳動(dòng)物中是否存在一類(lèi)主要定位于核內(nèi),專(zhuān)職介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的表觀調(diào)控的小RNA。我們分離mDC的胞漿、胞核兩個(gè)組分的RNA,進(jìn)行小RNA測(cè)序研究,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核內(nèi)的小RNA組的組分和特征有別于胞漿小RNA組,來(lái)源于重復(fù)序列,核小RNA(snRNA)和核仁小RNA(snoRNA)的小RNA主要定位于核內(nèi),而microRNA則主要定位在細(xì)胞漿中,同時(shí)核內(nèi)的小RNA的長(zhǎng)度分布也并不類(lèi)似于胞漿中以22nt為主的分布,富集于核內(nèi)的小RNA的5`端以A、T為主,3`端為C的比例較低,而在20-23nt的small RNAs中,較多以G結(jié)尾。我們將主要富集于核內(nèi)的小RNA命名為nlsRNA(nulear localized small RNA),這類(lèi)RNA產(chǎn)生部分依賴于Dicer酶的加工,但他們都不與AGO家族的蛋白相結(jié)合。 基于這類(lèi)nlsRNA可能通過(guò)與啟動(dòng)子部分匹配的模式來(lái)介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的表觀調(diào)控,我們分析了Dicer不依賴的nlsRNAs中表達(dá)量最高的一個(gè)nlsRNA,即nlsR-3的seed sequence與小鼠基因啟動(dòng)子區(qū)的互補(bǔ)位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)nlsR-3能夠特異性靶向小鼠iNOS啟動(dòng)子區(qū)的關(guān)鍵調(diào)控區(qū)域,同時(shí)通過(guò)其模擬物過(guò)表達(dá)和抑制物干擾等手段,發(fā)現(xiàn)其能夠抑制LPS誘導(dǎo)的iNOS的轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步研究其對(duì)iNOS表達(dá)的調(diào)控機(jī)制,發(fā)現(xiàn)nlsR-3能夠介導(dǎo)染色質(zhì)重塑抑制蛋白Mi-2β特異性靶向iNOS的啟動(dòng)子區(qū),抑制iNOS的表達(dá),同時(shí)能夠增加抑制性組蛋白修飾H3K27me3在iNOS啟動(dòng)子區(qū)的產(chǎn)生來(lái)抑制iNOS的表達(dá),并通過(guò)二者維持細(xì)胞靜息狀態(tài)下iNOS啟動(dòng)子區(qū)的染色質(zhì)關(guān)閉狀態(tài)。 綜上所述,我們通過(guò)大規(guī)模測(cè)序建立了人DC分化成熟的DNA甲基化譜、組蛋白修飾譜、mRNA表達(dá)譜和小RNA組,以及小鼠mDC的核小RNA組,以表觀遺傳組學(xué)的角度從面、線、點(diǎn)較深入地研究了表觀調(diào)控因子如何通過(guò)特異性調(diào)控DC功能相關(guān)的關(guān)鍵分子的表達(dá)來(lái)調(diào)控DC的分化成熟。我們系統(tǒng)分析了人DC分化成熟過(guò)程中的差異表觀修飾位點(diǎn)和差異表達(dá)基因,發(fā)現(xiàn)了DC成熟過(guò)程中受DNA甲基化調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。通過(guò)核質(zhì)分離小鼠mDC的小RNA,并結(jié)合高通量測(cè)序,我們發(fā)現(xiàn)了一群新的定位于核內(nèi)的小RNA,并初步探討了其介導(dǎo)表觀修飾酶特異性靶向DC功能相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū),調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的新機(jī)制。大量組學(xué)數(shù)據(jù)的獲得,為關(guān)于DC的表觀調(diào)控研究提供了特異性信息分析數(shù)據(jù)平臺(tái),也為在染色質(zhì)水平干預(yù)DC功能,以及以表觀調(diào)控為視角來(lái)提高DC疫苗效率、設(shè)計(jì)新的免疫治療調(diào)控靶點(diǎn)和藥物靶標(biāo)提供了線索和新的研究方向。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 任松葉;人類(lèi)及酵母基因組功能區(qū)的核小體定位預(yù)測(cè)[D];內(nèi)蒙古科技大學(xué);2012年

，

本文編號(hào)：1403172