本文關鍵詞：蓖麻毒素和相思子毒素A鏈突變體疫苗候選抗原的研究　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2011年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：背景:蓖麻毒素(ricin,RIC)和相思子毒素(abrin,ABR)是兩種植物來源的、毒性強的蛋白質毒素,二者分子結構相似,其全毒素均是由A、B兩條多肽鏈借助二硫鍵連接組成的異二聚體,相對分子質量在62～67 kDa之間。RIC和ABR均屬于Ⅱ型核糖體失活蛋白(RIP),它們的毒性作用機理相近,均是通過B鏈與細胞膜受體結合,幫助A鏈進入細胞質,從而發(fā)揮毒性作用。由于其毒性強、易于獲得和可氣溶膠化等特點,RIC和ABR被認為是重要的致死性生物毒素戰(zhàn)劑和生物恐怖劑,其對社會公共安全的潛在威脅不容忽視。但是目前針對RIC和ABR生物防護的疫苗研究還較少,因此,發(fā)展有效的應對RIC和ABR生物戰(zhàn)劑的醫(yī)學防護疫苗,具有十分重要的軍事和社會意義。 目的:本研究的目的就是構建RIC A鏈突變體(mRICA)和ABR A鏈突變體(mABRA)以及RIC、ABR A鏈突變體的嵌合體蛋白(mRICA/mABRA),實現mRICA、mABRA突變體蛋白和mRICA/mABRA嵌合體蛋白在原核表達系統(tǒng)內的可溶性表達、快速純化及抗原性分析,將其作為免疫原免疫動物,評價其對抗天然RIC和ABR中毒的免疫保護作用,篩選出有效的候選抗原,為制備RIC和ABR A鏈突變體疫苗奠定基礎。 方法:通過定點突變的方法獲得ABR A鏈突變體基因(mABRAE164AR167L和mABRAE164AR167LN200P),構建重組表達質粒pETHis-mABRA1和pETHis-mABRA2,分別轉化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS和BL21(DE3),經1.0 mM IPTG 30℃誘導表達,篩選出最佳表達工程菌BL21(DE3)pLysS/pETHis-mABRA1和BL21(DE3)pLysS/pETHis-mABRA2。應用前期已設計并合成的RIC A鏈突變體基因(mRICAD75AV76MY80A),構建重組表達質粒pETHis-mRICA和pET28a-mRICA,分別轉化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS和BL21(DE3),經0.5 mM IPTG 16℃誘導表達,篩選出最佳表達工程菌BL21(DE3)/pETHis-mRICA。采用柔性linker連接RIC A鏈突變體(mRICAD75AV76MY80A)和ABR A鏈突變體(mABRAE164AR167L)構建嵌合體基因mRICA/mABRA,將mRICA/mABRA嵌合體基因亞克隆至原核表達載體pQE-80L、pQE-30、pTIG-Trx、pET-28a ,構建重組表達質粒pQE80L-mRICA/mABRA、pQE30-mRICA/mABRA、pTIGTrx-mRICA/mABRA和pET28a-mRICA/mABRA,再分別轉化至大腸桿菌M15或BL21(DE3),工程菌在18℃經0.1 mM的IPTG誘導14 h ,篩選出最佳表達工程菌M15/pQE80L-mRICA/mABRA。表達的mRICA、mABRA1、mABRA2突變體蛋白以及mRICA/mABRA嵌合體蛋白經Ni-NTA親和層析柱純化,通過ELISA和WB印跡檢測四種蛋白的抗原性。將純化后的蛋白作為免疫原,采用以下五種形式與鋁佐劑混合后分別免疫Balb/c小鼠:mRICA、mABRA1、mABRA2、mRICA和mABRA1混合物以及嵌合體蛋白mRICA/mABRA。每種免疫原分兩種免疫途徑:肌肉注射和皮下多點注射,免疫以后血清中抗體效價采用間接ELISA方法進行檢測,用天然RIC和ABR對免疫后的Balb/c小鼠進行攻毒實驗,或收集免疫鼠血清與天然RIC和ABR在體外進行中和,分析五種免疫原的免疫保護效果。 結果:經過PCR和測序驗證,所構建的突變體基因mABRAE164AR167L、mABRAE164AR167LN200P和mRICAD75AV76MY80A與預期結果完全一致,mABRAE164AR167L和mABRAE164AR167LN200P全長753bp,編碼251個氨基酸殘基,mRICAD75AV76MY80A全長801bp,編碼267個氨基酸殘基。重組表達質粒pETHis-mABRA1、pETHis-mABRA2、pETHis-mRICA和pET28a-mRICA經PCR及雙酶切鑒定證明構建正確, mABRA1和mABRA2突變體蛋白的相對分子質量約為30 kDa, mRICA突變體蛋白的相對分子質量約為32 kDa,在大腸桿菌表達系統(tǒng)中均以可溶性和包涵體兩種形式表達,可溶性的mABRA1、mABRA2和mRICA經Ni-NTA親和層析柱純化后,蛋白純度均達98.5%以上,mABRA1和mABRA2可與抗天然ABR兔多克隆抗體發(fā)生特異抗原抗體反應,mRICA可與抗天然RIC兔多克隆抗體發(fā)生特異抗原抗體反應。所獲得的mRICA/mABRA嵌合體基因經一致性比對分析與預計嵌合基因的序列一致性為100%,其開放閱讀框架全長1572 bp,編碼524個氨基酸殘基。重組表達質粒pQE80L-mRICA/mABRA、pQE30-mRICA/mABRA、pTIGTrx-mRICA/mABRA和pET28a-mRICA/mABRA經PCR及雙酶切鑒定證明構建正確,嵌合體蛋白相對分子質量約為62 kDa,與預測的相符,可溶性的嵌合體蛋白經Ni-NTA親和層析柱純化,純度可達99%。間接ELISA和WB印跡結果表明,嵌合體蛋白能同時與抗RIC兔多克隆抗體和抗ABR兔多克隆抗體發(fā)生特異的抗原抗體反應。細胞毒性實驗證明,突變體蛋白mRICA的毒性降低到rRICA的1/2500-4100,天然RIC的1/8200-10000,突變體蛋白mABRA1的毒性降低到rABRA的1/1350,天然ABR的1/8000,突變體蛋白mABRA2的毒性降低到rABRA的1/2700-2800,天然ABR的1/16000-17000。 將mRICA、mABRA1、mABRA2蛋白分別免疫Balb/c小鼠,血清中檢測到相應的抗mRICA或抗mABRA特異性抗體,將mRICA和mABRA1混合物以及嵌合體蛋白mRICA/mABRA分別免疫Balb/c小鼠,血清中可同時檢測到抗mRICA和抗mABRA特異性抗體,間接ELISA結果表明,三免以后血清中相應抗體的效價均可達到1:106以上,而佐劑對照組則沒有抗體產生,免疫組和對照組血清抗體效價的差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05),而兩種免疫途徑,肌肉注射和皮下多點注射所產生的免疫效果沒有明顯差異(p0.05)。用天然RIC和ABR對免疫小鼠進行攻毒試驗,mRICA、mABRA1和mABRA2單獨免疫組小鼠或抗血清可以抵抗最高劑量為10×LD_(50)的天然毒素的攻擊,保護率均為100%。mRICA和mABRA1混合物免疫組可以抵抗最高劑量為5×LD_(50)天然RIC和ABR混合物的攻擊,6×LD_(50) RIC和ABR混合物攻擊時保護率為80%,8×LD_(50) RIC和ABR混合物攻擊時保護率為20%;而mRICA/mABRA嵌合體蛋白免疫組可以抵抗最高劑量為6×LD_(50) RIC和ABR混合物的攻擊,8×LD_(50) RIC和ABR混合物攻擊時保護率為60%,mRICA/mABRA嵌合體蛋白可達到與mRICA和mABRA1混合物同樣的免疫保護效果。 結論:本研究成功構建并表達了突變體蛋白mRICA、mABRA1、mABRA2以及嵌合突變體蛋白mRICA/mABRA,實現了四種蛋白在原核表達系統(tǒng)內的可溶性表達,通過抗原性檢測和細胞殺傷實驗驗證,所獲得的突變體蛋白和嵌合體蛋白均保留了良好的抗原性,同時大大降低了毒性,小鼠免疫和攻毒實驗結果表明利用構建的突變體蛋白和嵌合突變體蛋白作為免疫原作用于機體產生了良好的免疫刺激作用,免疫后小鼠或抗血清對致死劑量的天然RIC和ABR毒素的攻毒表現出較強的抵抗力和較好的免疫保護效果,為研制新型RIC和ABR疫苗奠定了重要基礎。
[Abstract]:Background : Ricin ( RIC ) and abrin ( abrin , ABR ) are two plant - derived proteins with strong toxicity . Their molecular structure is similar . The total toxin is a heterodimer composed of two disulfide bonds , and the relative molecular mass is between 62 and 67 kDa . The RIC and ABR are considered to be important lethal biological toxin warfare agents and bioterrorism agents . Objective : The purpose of this study was to construct the recombinant protein ( mBRA ) of RIC A - chain mutant ( mABRA ) and ABR A - chain mutant ( mABRA ) , and to realize the soluble expression , rapid purification and antigenic analysis of mBRA mutant protein and mBRA chimeric protein in prokaryotic expression system . It was used as immunogen to evaluate the immune protective effect against natural RIC and ABR poisoning , and to screen out the effective candidate antigen , thus laying the foundation for preparing RIC and ABR A - chain mutant vaccine . coli BL21 ( DE3 ) pLys S / pETHis - mABRA2 . The recombinant expression plasmid pQE80L - mBRA1 and pET28a - mBRA2 were transformed into E . coli BL21 ( DE3 ) pLys S / pETHis - mABRA2 . The recombinant expression plasmid pQE80L - mBRA1 and pET28a - mABRA2 were constructed . The results showed that mABRA1 , mABRA1 , mABRAE164AR167LN200P and mRICAD75AV76MY80A were constructed correctly by PCR and sequencing . The relative molecular mass of mABRA1 , mABRA2 and mABRAE164AR167LN200P was about 801bp . The anti - mAbRA1 , mABRA1 and mABRA1 mixture were challenged with the highest dose of 5 脳 LD _ ( 50 ) RIC and ABR mixture , and the protective rate was 20 % . The mBRA1 and mABRA1 mixture could resist the highest dose of 6 脳 LD _ ( 50 ) RIC and ABR mixture . The protective rate was 60 % when the mixture was challenged with 8 脳 LD _ ( 50 ) RIC and ABR mixture . Conclusion : This study successfully constructed and expressed the mutant protein mRNA, mABRA1 , mABRA2 , and chimeric mutant protein muclei / mABRA . The results showed that the mutant protein and the chimeric protein had good antigenicity . The results showed that the mutant protein and the chimeric protein had good antigenicity . The results showed that the mutant protein and the chimeric mutant protein were used as the immunogen to generate good immune stimulation . The challenge of the immunized mice or the antiserum against the lethal dose of the natural RIC and ABR toxin showed stronger resistance and better immune protection effect , thus laying the important foundation for the development of new RIC and ABR vaccines .

【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392.1

【參考文獻】

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本文編號：1395969