本文關(guān)鍵詞：鹽酸小檗堿通過SortaseA和Esp途徑影響糞腸球菌生物被膜的初步探討　出處：《中南大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 生物被膜 糞腸球菌 轉(zhuǎn)肽酶A 糞腸球菌表面蛋白 鹽酸小檗堿

【摘要】：1.糞腸球菌生物被膜形成的動(dòng)態(tài)觀察及早期相關(guān)基因的表達(dá)研究 目的：建立糞腸球菌生物被膜(biofilm, BF)體外模型,觀察生物被膜形成發(fā)展過程中空間立體結(jié)構(gòu)上的動(dòng)態(tài)變化；探討sortaseA (轉(zhuǎn)肽酶A編碼基因)基因、esp(腸球菌表面蛋白)與糞腸球菌生物被膜形成早期的相關(guān)性,以利于臨床尋找藥物靶點(diǎn),提高用藥效率。 方法： (1)臨床篩選并鑒定尿路感染相關(guān)性糞腸球菌生物被膜菌,分為生物被膜菌組及生物被膜陰性組,結(jié)晶紫染色法定量檢測生物被膜量。 (2)采用玻片法體外建立糞腸球菌生物被膜模型,分別培養(yǎng)1、8、16、24、48及72h,利用激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)及熒光顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察生物被膜形成發(fā)展過程中的空間結(jié)構(gòu)變化。 (3)利用實(shí)時(shí)定量PCR方法相對(duì)定量檢測esp、 sortaseA在生物被膜早期菌和生物被膜陰性菌中的表達(dá)差異,做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果： (1)本院99例尿路感染患者導(dǎo)尿管中共篩選出生物被膜菌36株,陽性率36.4%。其中糞腸球菌占生物被膜菌的27.8%。 (2)結(jié)晶紫染色定量顯示菌株在1、8、16h生物被膜逐漸形成,24h趨于頂峰,隨后生物被膜量回落,48h有減少,72h進(jìn)一步減少。 (3)菌株培養(yǎng)在16小時(shí)基本形成,24小時(shí)成熟,48小時(shí)有播散。隨著生物被膜形成過程的進(jìn)展,死菌量及活菌量逐漸增多,到48h開始有所減少；細(xì)菌總量由粘附面到游離面逐漸減少；中間層活菌量密度最高。 (4) sortaseA、 esp基因的表達(dá)與糞腸球生物被膜菌形成早期具有相關(guān)性。生物被膜早期菌組sortaseA、 esp表達(dá)量分別是生物被膜陰性菌組的7.9與13.5倍。 小結(jié)： (1)本研究細(xì)菌尿路感染中,生物被膜菌檢出率為36.3%.其中以糞腸球菌所占生物被膜菌比例最大(27.8%)。這一結(jié)果與我們實(shí)驗(yàn)室三年前研究的結(jié)論基本一致,提示本院在近三年留置導(dǎo)尿管相關(guān)的尿路感染生物被膜菌分布變化不明顯。 (2)利用熒光顯微鏡及CLSM觀察,證實(shí)了糞腸球菌BF形成和發(fā)展經(jīng)歷了最初的定植及不可逆黏附等早期階段、結(jié)構(gòu)分化階段、發(fā)展成熟階段、和解聚再定植階段。細(xì)菌總量由粘附面到游離面逐漸減少；中間層活菌量密度較高。 (3)sortaseA、 esp基因與糞腸球生物被膜菌形成早期密切相關(guān),在生物被膜形成早期上調(diào)。 2.鹽酸小檗堿對(duì)糞腸球菌生物被膜形成的影響 目的：研究鹽酸小檗堿對(duì)糞腸球菌生物被膜形成的影響,并探討其作用機(jī)制。 方法：以生物被膜量較強(qiáng)的菌株EF06為研究對(duì)象,將鹽酸小檗堿處理菌株EF06的不同分為兩組,甲組為不同濃度鹽酸小檗堿與EF06共同孵育24h；乙組為EF06培養(yǎng)24h后與不同濃度鹽酸小檗堿再共培24h。熒光顯微鏡觀察藥物未處理組和處理組之間的差異。結(jié)晶紫染色法定量檢測不同處理組內(nèi)生物被膜形成量和生物被膜量的差異,做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果： (1)熒光顯微鏡檢測,甲處理組中鹽酸小檗堿作用濃度在20μg/ml和40μg/ml時(shí),EF06細(xì)菌密度略高于藥物未處理組,但隨著藥物濃度的增加,細(xì)菌密度逐漸減少。乙處理組鹽酸小檗堿作用濃度在200,400和600μg/ml時(shí),生物被膜結(jié)構(gòu)上未見明顯的變化,當(dāng)達(dá)到800μg/ml時(shí)生物被膜厚度有所減少,達(dá)到1000瞻/ml,生物被膜厚度減少明顯。 (2)結(jié)晶紫染色定量測得OD600值。在甲組,藥物濃度為20、40μg/ml與0μg/ml比較,p0.05；藥物濃度60、80和100μg/ml與0μg/ml比較,p0.05；藥物濃度60、80與100μg/ml之間兩兩比較,p0.05,前者大于后者。在乙組,藥物濃度為200、400及600μg/ml與0μg/ml比較,p0.05,藥物濃度800和1000μg/ml與0μg/ml比較,p0.05,藥物濃度800與1000μg/ml比較,p0.05,前者大于后者。 小結(jié)： (1)鹽酸小檗堿對(duì)糞腸球菌生物被膜的形成有抑制作用,藥物濃度達(dá)到60μg/ml后,其抑制作用與藥物作用濃度成正相關(guān)。 (2)鹽酸小檗堿降低糞腸球菌生物被膜量,濃度從800μg/ml開始,隨著濃度增加,生物被膜量逐漸減少。
[Abstract]:Study on the dynamic observation of biofilm formation of 1. Enterococcus faecalis and the expression of early related genes
Objective: to establish the Enterococcus faecalis biofilm (biofilm, BF) in vitro model, observe bio dynamic changes of space in the process of the development of three-dimensional structure of film forming; sortaseA (GGT gene encoding A gene (ESP), enterococcal surface protein) and Enterococcus faecalis biofilm formation in early correlation to clinical searching for drug targets, improve administration efficiency.
Method錛，

本文編號(hào)：1390035