發(fā)布時間：2018-01-06 10:18

  本文關鍵詞：TGF-β1在雷奈酸鍶促進大鼠骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化中的作用　出處：《南方醫(yī)科大學》2012年碩士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 雷奈酸鍶 大鼠骨髓間充質干細胞 成骨細胞 TGF-β1 Runx2

【摘要】：研究目的 雷奈酸鍶(Strontium ranelate,Sr)是一種用于治療骨質疏松的新型藥物,它具有使大鼠骨髓間充質干細胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs)向成骨細胞方向轉化的作用,除此之外,它還有改善骨強度,促進新生血管形成等其它重要的功能。研究表明Sr可通過細胞外信號調節(jié)激酶1/2(extracellular signal regulated kinase1/2,ERK1/2)和P38絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路調節(jié)成骨細胞特異性轉錄因子Runx2(Cbfal)的轉錄活性,Runx2則調節(jié)下游成骨基因,如骨鈣素(osteocalcin,OCN)、骨橋蛋白(osteopontin,OPN)、Ⅱ型膠原(Collagen type Ⅱ,COL Ⅱ)的表達,促進BMSCs的成骨分化。 轉化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)是屬于轉化生長因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)超家族成員之一,它有著極其廣泛的生物學功能,不僅調控rBMSCs的生長發(fā)育和分化,而且能促進rBMSCs向成骨細胞的發(fā)育和轉化,調控成骨細胞的生長發(fā)育和增殖,在合成骨基質和形成骨重建方面也起著重要的作用,是調控rBMSCs生長發(fā)育和向成骨細胞分化的首選的生長因子之一；它還可參與調控多種細胞的生長發(fā)育和生物學功能。相關資料表明,TGF-β1可能在鍶促進rBMSCs向成骨細胞分化的過程中起著重要的作用。但是,TGF-β1在Sr促進rBMSCs向成骨細胞分化中的作用如何迄今未見報道。本文旨在重點探討：①Sr對rBMSCs的TGF-β1表達的影響；②TGF-β1是否在Sr促進rBMSCs向成骨細胞分化中起作用,以便為Sr的促成骨作用機制提供新穎的實驗資料。 研究方法 1.建立rBMSCs體外分離、培養(yǎng)的方法體系。 取四周齡,雌雄不限SD大鼠,取出大鼠雙側的股骨,脛骨,用全骨髓貼壁的方法分離出rBMSCs,用含培養(yǎng)液的10m1注射器從大鼠骨髓中將rBMSCs從骨髓中沖洗出來,直至骨髓腔發(fā)白,將收集好的細胞懸液離心,去上清,置于25cm2培養(yǎng)瓶中,并于37℃、5%C02、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng),當細胞鋪滿瓶底80%左右時進行傳代培養(yǎng)和適當?shù)膬龃�。并取�?-5代的細胞用于實驗。用倒置顯微鏡觀察細胞生長發(fā)育狀態(tài),并鑒定所培養(yǎng)的細胞為骨髓間充質干細胞。 2.定向誘導rBMSCs向成骨細胞分化 取生長狀態(tài)良好的第3-5代rBMSCs,調整其濃度為105/ml左右,取細胞懸液4ml接種,并用成骨誘導液(含10-8的地塞米松,0.2mM的維生素C,10mMβ-甘油磷酸鈉)培養(yǎng),當細胞融合達到60%-70%時,進行實驗操作。 3.實驗分組 (1)堿性磷酸酶(ALP)指標測定的實驗分組 ①分為六組,分別設不同的濃度誘導rBMSCs,分別為對照組、Sr=0.1、Sr=l、Sr=3、Sr=5、Sr=7mM,每組設5復孔,六組均在成骨誘導液條件下誘導rBMSCs7天。當Sr=3mM時,ALP活性最大。 ②分為五組,分別為對照組：成骨誘導液培養(yǎng)；Sr組：3mM Sr+成骨誘導液培養(yǎng)；Sr+SB組：Sr+SB431542+成骨誘導液：先用10gmol/L SB431542(TGF-β1抑制劑)預處理rBMSCs2小時,然后加3mM Sr；SB431542組：SB431542+成骨誘導液：先用10μmol/L SB431542預處理rBMSCs2小時；DMSO組：DMSO+成骨誘導液,用10μmol/LDMSO培養(yǎng)；共培養(yǎng)rBMSCs7天,測定ALP活性。 (2)茜素紅鈣結節(jié)染色的實驗分組 ①分為兩組,分別設不同的濃度誘導rBMSCs。對照組：用成骨誘導液培養(yǎng)；Sr組：3mM Sr+成骨誘導液,共培養(yǎng)21天。 ②分為五組,分別為對照組：成骨誘導液培養(yǎng)；Sr組：3mM Sr+成骨誘導液；Sr+SB431542組：Sr+SB431542+成骨誘導液,先用10gmol/L SB431542預處理rBMSCs2小時,然后加3mM Sr；SB431542組：SB431542+成骨誘導液：先用10μmol/L SB431542預處理rBMSCs2小時；DMSO+成骨誘導液組：用10μmol/LDMSO培養(yǎng)：共培養(yǎng)rBMSCs21天,測定鈣結節(jié)數(shù)目。 (3)TGF-β1蛋白表達的實驗分組 ①分為六組,分別設不同的濃度誘導rBMSCs.分為對照組、Sr=0.1、Sr=1、Sr=3、Sr=5、Sr=7mM六組,在成骨誘導液中培養(yǎng)7天。當Sr=l mM時,TGF-β1蛋白表達最高。 ②分為六組,分別設不同的時間誘導rBMSCs.分為對照組、t=1、t=3、t=5、t=7、t=10天六組。各組中所用Sr=l mM。當t=7天時,TGF-β1蛋白表達最高。 ③分為五組,分別為對照組：用成骨誘導液培養(yǎng)；Sr組：1mM Sr+成骨誘導液；Sr+SB431542組：Sr+SB431542+成骨誘導液,先用10μmol/L SB431542預處理rBMSCs2小時,然后加1mM Sr；SB431542組：10μmol/L SB431542+成骨誘導液：先用10μmol/L SB431542預處理rBMSCs2小時；DMSO組：DMSO+成骨誘導液,用10μmol/LDMSO培養(yǎng)；共培養(yǎng)rBMSCs7天,用western-blot檢測TGF-β1蛋白表達情況。 (4) Runx2mRNA表達情況分組 ①分為六組,分別設不同的濃度誘導rBMSCs。對照組、Sr=1、Sr=2、Sr=5、Sr=7、Sr=10mM六組,在成骨誘導液中培養(yǎng)7天。當Sr=l mM時,Runx2mRNA表達最高。 ②分為八組,分別設不同的時間誘導rBMSCs。對照組、t=0.5h、t=1h、t=2h、t=4h、t=3d、t=7d、t=14d。各組所用Sr=l mM。當t=7天時,Runx2mRNA表達最高。 ③分為五組,分別為對照組：用成骨誘導液培養(yǎng)；Sr組：1mM Sr+成骨誘導液；Sr+SB431542組：Sr+SB431542+成骨誘導液,先用10μmol/L SB431542預處理rBMSCs2小時,然后加1mM Sr；SB431542組：10μmol/L SB431542+成骨誘導液：先用10μmol/L SB431542預處理rBMSCs2小時；DMSO組：DMSO+成骨誘導液,用10μmol/LDMSO培養(yǎng)；共培養(yǎng)rBMSCs7天,PT-PCR檢測Runx2mRNA表達情況。 研究結果 1、大鼠骨髓間充質干細胞的形態(tài)學觀察 倒置相差顯微鏡觀察顯示：rBMSCs的接種初期可見大量圓形的懸浮細胞。隨培養(yǎng)時間的延長,細胞形狀漸趨向于多角形或梭形,大多數(shù)細胞在24小時之內貼壁,這一代細胞為原代細胞,當原代細胞培養(yǎng)至一星期左右時,細胞貼壁可達70%-80%；經過多次細胞換液后,我們發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)逐漸趨向一種,呈成纖維樣細胞,當細胞逐漸融合之后,呈漩渦狀、輻射狀。當細胞融合至80%左右,應按1：2的比例傳代。 2、Sr增加rBMSCs的ALP活性 應用濃度分別為0、0.1、1、3、5、7mM的Sr分別處理rBMSCs7天,測定ALP的OD值。應用單因素方差分析顯示總體均數(shù)間有顯著統(tǒng)計學差異(F=44.092,P0.001),各組與對照組相比均能增加rBMSCs ALP活性(P0.05),其中當Sr的濃度為3mM時,rBMSCsALP活性的作用最大,與各組相比較均有統(tǒng)計學意義(P0.05)；在用3mM Sr處理細胞前2小時,應用10μmol/LSB431542預處理rBMSCs,共培養(yǎng)7天,測定ALP的OD值。應用單因素方差分析顯示總體均數(shù)間有顯著統(tǒng)計學差異(F=5.053,P0.001)。應用3mM Sr處理細胞7天可明顯增加ALP活性,與各組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),在用3mM Sr處理細胞前2小時,應用10μmol/L SB431542預處理rBMSCs,可明顯地抑制Sr對ALP活性的促進作用,與Sr組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),對照組、SB431542組、DMSO組三組間無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 3、Sr促進rBMSCs的鈣結節(jié)形成 應用濃度分別為0、3mM Sr分別處理rBMSCs21天。應用獨立樣本T檢驗顯示當我們用3mM Sr作用rBMSCs21天時,可明顯增加鈣結節(jié)數(shù)量,與對照相比較有統(tǒng)計學差異(t=-9.865,P0.001)；在3mM Sr處理rBMSCs前2小時,10μtmol/L SB431542預處理細胞2小時,共培養(yǎng)21天。用單因素方差分析顯示總體均數(shù)間有顯著統(tǒng)計學差異(F=19.161,P0.001),Sr組可明顯增加鈣結節(jié)的數(shù)量,與任意一組比較均有統(tǒng)計學意義(P0.05),在3mM Sr處理rBMSCs前2小時,10μmol/L SB431542預處理細胞2小時能明顯地抑制Sr對鈣結節(jié)形成的促進作用,兩組相比有統(tǒng)計學差異(P0.05),對照組、SB組、DMSO組三組間無統(tǒng)計學差異(P0.05)。 4、Sr對rBMSCs TGF-β1蛋白表達的影響 應用0、0.1、1、3、5、7mM Sr分別處理rBMSCs7天。用單因素方差分析示總體均數(shù)間有顯著統(tǒng)計學差異(F=583.858,P0.001),0.1-5mM Sr各組較均可顯著地上調TGF-β1的表達,與對照組比較有統(tǒng)計學意義(P0.05),其中當Sr濃度為1mM時,TGF-β1表達達到高峰,與各組相比有統(tǒng)計學差異(P0.05),但當Sr=7mM時,Sr對TGF-β1表達無明顯作用,與對照組比較,無統(tǒng)計學差異(P0.05)；在1到10天的時間范圍內,用1mM Sr誘導細胞。用Welch校正法可知總體均數(shù)間有統(tǒng)計學差異(P0.001),各組呈時間依賴性地促進TGF-β1表達,在第7天時TGF-β1表達達到高峰,與各組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01),第10天時Sr對TGF-β1的表達無明顯增加,與對照組相比無統(tǒng)計學差異(P0.05)；應用1mM Sr處理rBMSCs前2小時,給予10μmol/L SB431542預處理,共培養(yǎng)7天。用單因素方差分析示總體均數(shù)間有顯著統(tǒng)計學差異(F=314.375,P0.001),其中1mM Sr可明顯的促進TGF-β1的表達,與其余各組比較,有顯著統(tǒng)計學差異(P0.01),加入SB431542后可明顯地抑制Sr對TGF-β1表達的上調作用,兩組相比有顯著統(tǒng)計學差異(P0.01),對照組、SB組、DMSO組三組間無統(tǒng)計學差異(P0.05)。 5、Sr對rBMSCs Runx2mRNA表達的影響 應用0、1、2、5、7、10mM Sr分別處理rBMSCs7天。用單因素方差分析可知總體均數(shù)間有顯著統(tǒng)計學差異(F=985.949,P0.001),應用1-5mM Sr時可顯著地上調Runx2mRNA的表達,其中濃度為1mM時,Runx2mRNA表達達到高峰,與對照組相比有統(tǒng)計學差異(P0.01),當Sr=7和Sr=10mM時,Runx2mRNA表達均明顯下降,與對照組比較有統(tǒng)計學差異(P0.01)；在0.5小時-14天的時間范圍內,1mM Sr培養(yǎng)細胞。用單因素方差分析可知總體均數(shù)間有顯著統(tǒng)計學差異(F=353.551,P0.001),Sr呈時間依賴性地促進Runx2mRNA表達,在第7天時Runx2mRNA表達達到高峰,與其余各組比較有顯著統(tǒng)計學差異(P0.01)；在應用1mM Sr處理rBMSCs前2小時,給予10μmol/L SB431542預處理,共培養(yǎng)7天。單因素方差分析可知總體均數(shù)間有顯著統(tǒng)計學差異(F=5510.983,P0.001),1mM Sr可明顯的促進Runx2mRNA表達,與對照組相比(P0.01),加入阻斷劑后可明顯地抑制Sr對Runx2mRNA表達的上調作用,兩組比較有顯著統(tǒng)計學差異(P0.01),對照組、SB組、DMSO組三組間無統(tǒng)計學差異(P0.05)。 結論 1、應用全骨髓貼壁法分離、提純、培養(yǎng)rBMSCs較其它方法安全、方便；rBMSCs在應用成骨誘導液培養(yǎng)條件下,可向成骨細胞分化,具有成骨分化的潛能。 2、Sr可較好的誘導rBMSCs分化為成骨細胞,此作用可能與其上調TGF-β1-Runx2表達有關。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R329

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 徐凌霄;高俊;張前德;;左歸丸含藥血清對大鼠骨髓間充質干細胞骨向分化中堿性磷酸酶含量的影響[J];中國實驗方劑學雜志;2011年07期

2 楊成林;畢鄭鋼;劉勇;王玉學;祁權;;兔骨髓基質細胞向成骨細胞分化過程的超微形態(tài)結構觀察[J];中華顯微外科雜志;2007年04期

3 楊成林,畢鄭鋼,王玉學,祁權,付春江,陶天遵;兔骨髓基質細胞體外成骨分化鑒定及與煅燒骨復合培養(yǎng)的實驗研究[J];中國骨質疏松雜志;2005年03期

4 姜文雄;孟國林;劉建;楊鵬;李強;;Ι型骨質疏松山羊骨髓基質細胞體外成脂、成骨分化的研究[J];科學技術與工程;2006年21期

5 王慶德;楊述華;楊操;胡勇;趙繼軍;潘曉華;;低氧抑制人骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化[J];華中科技大學學報(醫(yī)學版);2008年01期

6 張曉慧,傅晉翔;臍靜脈源MSC分離及生物學特性[J];江蘇醫(yī)藥;2005年10期

7 王君;魏義勇;;黃芪對脂肪源性干細胞成骨作用的初步探討[J];寧夏醫(yī)科大學學報;2011年08期

8 郭國寧,張正豐,周躍,張偉,曹國永;Cbfa1基因轉移對原代培養(yǎng)的兔皮膚成纖維細胞的影響[J];重慶醫(yī)學;2005年08期

9 郭延云;朱翔;章秋;;低密度脂蛋白受體相關蛋白5與骨密度的關系[J];中國臨床保健雜志;2006年02期

10 李華壯;周躍;郭國寧;郭志良;曹國永;;AdEasy1/Cbfα_1誘導間充質干細胞向成骨細胞分化的實驗研究[J];西北國防醫(yī)學雜志;2006年03期

相關會議論文 前10條

1 謝晶日;李明;;益氣養(yǎng)陰活血法對胃癌前病變大鼠TGF-β1的影響[A];第二十二屆全國中西醫(yī)結合消化系統(tǒng)疾病學術會議暨消化疾病診治進展學習班論文匯編[C];2010年

2 李豐衣;張琳;孫勁暉;田德祿;祝世功;劉霞;王慶寶;;調肝理脾方對酒精性肝纖維化大鼠轉化生長因子(TGF-β1)蛋白表達的影響[A];第十二屆中國科協(xié)年會22分會場——“中醫(yī)藥在重大公共衛(wèi)生事件中的地位和作用論壇”論文集[C];2010年

3 李豐衣;張琳;孫勁暉;田德祿;祝世功;劉霞;王慶寶;;調肝理脾方對酒精性肝纖維化鼠大轉化生長因子(TGF-β1)蛋白表達的影響[A];經濟發(fā)展方式轉變與自主創(chuàng)新——第十二屆中國科學技術協(xié)會年會（第三卷）[C];2010年

4 許斌;;曲格列酮對TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞合成纖維連接蛋白和Ⅰ型膠原纖維的影響[A];2010年江蘇省藥學大會暨第十屆江蘇省藥師周大會論文集[C];2010年

5 張昱;李琦;;中藥灌腸對慢性腎衰竭患者腎功能及血TGF-β_1的影響[A];中國中西醫(yī)結合學會養(yǎng)生學與康復醫(yī)學專業(yè)委員會委員會議暨第七次學術研討會論文集[C];2011年

6 尹禮烘;趙鳳達;梁建萍;周榮偉;章衛(wèi)華;;涼血化瘀法防治放射性肺損傷及對TGF-β_1表達的影響[A];江西省中西醫(yī)結合學會第九次活血化瘀學術研討會活血化瘀臨床應用新進展培訓班論文集[C];2011年

7 朱斌;朱彩鳳;林宜;朱曉玲;黃陳招;魯盈;;大黃素通過阻斷多通路抑制TGF-β1誘導的腎成纖維細胞分泌細胞外基質[A];第十一屆全國中西醫(yī)結合腎臟病學術會議論文匯編[C];2010年

8 楊汝春;張華琴;朱曉玲;魯盈;;黃芪對TGF-β1刺激的足細胞骨架蛋白表達異常的干預作用[A];第十一屆全國中西醫(yī)結合腎臟病學術會議論文匯編[C];2010年

9 張繼東;馮利;劉春喜;王博;任敏;郭雪峰;;芩丹膠囊對老年自發(fā)性高血壓大鼠血管外膜重構以及TGF-β1表達的影響[A];第十次中國中西醫(yī)結合學會心血管病學術大會暨第五次江西省中西醫(yī)結合學會心血管病學術大會論文匯編[C];2010年

10 趙凱;屠文震;;抗硬化復方對硬皮小鼠皮膚TGF-β_1表達的影響[A];首屆中國中西醫(yī)結合風濕病西北學術會議暨培訓班論文匯編[C];2011年

相關重要報紙文章 前10條

1 殷曉雪 陳仲強 黨耕町;北京大學——淫羊藿苷可促進人成骨細胞增殖與分化[N];中國醫(yī)藥報;2006年

2 蔣銳;用患者骨細胞構建修復材料[N];健康報;2006年

3 ;地塞米松對骨髓基質干細胞生物學特性的影響[N];中國醫(yī)藥報;2003年

4 馮友根;辛伐他汀促成骨作用研究[N];中國醫(yī)藥報;2004年

5 吳一福;軍事醫(yī)學科學院從MSCs中篩選出重要差異蛋白[N];中國醫(yī)藥報;2006年

6 孫 敏;脂質及代謝調節(jié)物影響骨重構[N];中國中醫(yī)藥報;2003年

7 楊建輝;雌三醇對成骨細胞保護作用的研究[N];中國中醫(yī)藥報;2004年

8 上海香料研究所 朱立弘;化妝品用添加劑初乳精華素有待被認知[N];中國化工報;2001年

9 蔣銳;我國組織工程骨應用研究獲成果[N];中國醫(yī)藥報;2006年

10 本報記者 白曉蕓;脾腎兩虛為骨質疏松癥的基本病機[N];中國中醫(yī)藥報;2002年

相關博士學位論文 前10條

1 傅德皓;骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2誘導成骨過程中血管內皮生長因子的表達及意義[D];華中科技大學;2006年

2 夏揚;海藻酸鈉—明膠共混體系為載體的可注射式組織工程骨的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2008年

3 趙煜;磁性附著體模擬靜磁場對成骨細胞生物學效應的基礎研究[D];四川大學;2006年

4 趙子義;骨髓間充質干細胞構建組織工程化骨與軟骨的實驗研究[D];吉林大學;2005年

5 裴育;生長因子對成骨細胞特異轉錄因子Cbfal基因表達的影響以及Cbfal基因多態(tài)性與骨質疏松的關系[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2003年

6 張科強;沖擊波誘導人骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化的機制[D];吉林大學;2008年

7 陸蘊松;重組低氧誘導因子-1α對成骨細胞功能調控的實驗研究[D];吉林大學;2009年

8 李文鋒;炎癥對骨折愈合過程中成骨細胞分化的影響及分子機制[D];南方醫(yī)科大學;2010年

9 馬杰;全身照射引起小鼠Flk-1～+骨髓間充質干細胞細胞衰老不相關的成骨潛能改變及其與骨骼和造血系統(tǒng)損傷的關系[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2007年

10 鐘招明;生長分化因子-5誘導人黃韌帶細胞成骨分化的作用及機制[D];南方醫(yī)科大學;2009年

相關碩士學位論文 前10條

1 王小娜;TGF-β1在雷奈酸鍶促進大鼠骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化中的作用[D];南方醫(yī)科大學;2012年

2 范右飛;成人隱匿性自身免疫性糖尿病患者血清IL-10、TGF-β水平及其與胰島β細胞功能的關系[D];山東大學;2010年

3 曹碩;TGF-β1、血管緊張素Ⅱ、醛固酮與放射性肺損傷的關系[D];中國醫(yī)科大學;2010年

4 于小峰;強脈沖光對成纖維細胞分泌TGF-β1的影響及信號通路研究[D];中南大學;2010年

5 孟憲兵;家兔蛛網膜顆粒形態(tài)結構及蛛網膜下腔出血后蛛網膜顆粒TGF-β1表達的研究[D];河北醫(yī)科大學;2011年

6 張思慧;載TGF-β_1微球涂層多孔鈦對成骨細胞功能的影響[D];中南大學;2010年

7 袁小洪;重組腺相關病毒介導TGF-β_1基因修飾脂肪干細胞成軟骨細胞的研究[D];遵義醫(yī)學院;2010年

8 洪偉;自體PRP對鈦表面成骨細胞分化的影響及TGF-β1的變化[D];河北醫(yī)科大學;2012年

9 衛(wèi)琴;荷瘤小鼠髓系抑制性細胞比例和TGF-β_1表達水平關系的研究[D];山西醫(yī)科大學;2010年

10 李強;TGF-β1對大鼠脂肪干細胞體外軟骨形成能力影響的研究[D];中南大學;2010年

，

本文編號：1387436