本文關鍵詞：MDCK細胞培養(yǎng)的甲型H1N1流感病毒疫苗研究　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2011年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：流行性感冒簡稱流感,是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。流感的發(fā)病率為各種傳染性疾病之首,是嚴重危害人類健康的重要傳染病之一。據(jù)2011年世界衛(wèi)生組織報告,全球每年約有6億～l2億人感染流感,其中死亡50萬～100萬人。甲型流感病毒常引起世界性流感大流行,對人類威脅極大。眾所周知,上世紀爆發(fā)的“西班牙流感”、“亞洲流感”、“香港流感”三次大流感流行,分別由甲型H1N1、甲型H2N2和甲型H3N2亞型流感病毒引起,造成了數(shù)千萬人死亡,給人類健康和經濟造成了巨大危害和損失。隨著全球氣候和生態(tài)環(huán)境變化,流感對人類健康和公共衛(wèi)生安全危害日益嚴重,特別是近年來人感染高致病性H5N1禽流感,以及2009年在墨西哥爆發(fā)的甲型H1N1流感,再一次給人們敲響了警鐘,人類流感的防控極其重要。 接種疫苗是防控流感爆發(fā)最經濟、有效的手段。目前,流感疫苗主要的生產介質是雞胚,然而雞胚來源的疫苗存在著質量難以控制、生產周期長、易引起過敏,一旦流感爆發(fā)其來源將成為瓶頸,無法及時應對流感疫情等問題。因此,開發(fā)新的人用流感疫苗生產介質已成為疫苗生產的關鍵,WHO推薦細胞是生產疫苗的優(yōu)良介質。采用細胞進行流感疫苗的發(fā)酵生產,其質量可控性好,封閉的生產體系方便安全,可以根據(jù)需求大批量發(fā)酵生產,避免了由于流感大流行造成雞胚供應不足而影響疫苗產量的缺點。目前,獲準生產人用流感疫苗的細胞系主要有Vero細胞和MDCK細胞。據(jù)報道,已有企業(yè)利用Vero細胞和MDCK細胞通過微載體系統(tǒng)進行發(fā)酵生產制備人用流感疫苗。Baxter公司已經于2009年通過Vero細胞技術平臺生產了禽流感疫苗CELVAPAN并上市,Novartis公司于2007年用MDCK細胞生產了流感疫苗Optaflu并上市,同時Novartis公司于2009年又通過細胞培養(yǎng)技術生產了甲型H1N1流感疫苗。 采用細胞進行流感疫苗的制備,存在的主要問題是流感病毒產量低。人流感病毒主要通過結合到細胞表面的唾液酸寡糖上進行吸附感染,該唾液酸寡糖類型是N-乙酰唾液酸末端通過α2,6糖苷鍵連接到半乳糖上的(NeuAcα2,6 Gal)。雖然MDCK細胞和Vero細胞表面都有這種類型的唾液酸寡糖,但是豐度并不高。同時,細胞表面流感病毒受體的類型和數(shù)量存在著個體差異。另外,流感病毒在不同的細胞內復制效率的高低也可能存在著個體化差異。所以可以通過篩選單克隆細胞株的方法來獲得流感病毒適應性細胞。由于MDCK細胞對流感病毒的適應性要好于Vero細胞,所以可以篩選MDCK單克隆細胞株來獲得對流感病毒高產的細胞株,以實現(xiàn)流感病毒在哺乳動物細胞中能夠高效復制擴增的目的。 為了實現(xiàn)利用細胞代替雞胚來生產制備流感疫苗的目的,我們篩選獲得能夠產生較高病毒滴度的細胞株和病毒株,進而優(yōu)化細胞和病毒培養(yǎng)條件,并進行大規(guī)模生產制備流感疫苗。我們通過兩方面進行篩選:第一,通過有限稀釋法制備單克隆細胞株,使用流感病毒進行感染,從而篩選出適應流感病毒的單克隆細胞株;第二,篩選流感病毒株,用不同的流感病毒株感染單克隆MDCK細胞株,篩選出可以產生較高病毒滴度的流感病毒株。通過以上兩方面的篩選,獲得能夠產生較高病毒滴度的細胞株和病毒株,并進一步經培養(yǎng)條件優(yōu)化,擴大培養(yǎng),為使用哺乳動物細胞進行大規(guī)模生產制備流感疫苗奠定基礎,為流感爆發(fā),能夠及時大規(guī)模生產制備流感疫苗提供了技術保證,因此具有重大意義。 本課題的研究目的主要是通過有限稀釋法制備單克隆細胞株,篩選出適應流感病毒高滴度復制的單克隆細胞株;用不同的流感病毒株感染單克隆細胞株,篩選出能產生較高病毒滴度的流感病毒株;將篩選獲得的單克隆細胞株和流感病毒株進行條件優(yōu)化,擴大培養(yǎng),從而制備流感疫苗,為細胞代替雞胚大規(guī)模生產制備流感疫苗奠定基礎。 本研究主要包括以下三個部分: 第一、甲型H1N1流感病毒株和MDCK單克隆細胞株的篩選、鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化。通過有限稀釋法制備MDCK單克隆細胞株,建立MDCK單克隆細胞庫。使用不同的甲型H1N1流感病毒株感染MDCK單克隆細胞株,通過血凝滴度檢測篩選出能夠產生較高病毒滴度的細胞株和病毒株。經篩選后獲得能產生較高病毒滴度的細胞株和病毒株分別為M77單克隆細胞株和甲型H1N1流感病毒株A/Beijing/501/2009。對篩選到的細胞株和病毒株進行TCID50滴度測定、空斑形成試驗、細胞表面NeuAcα2,6 Gal豐度測定、細胞株遺傳穩(wěn)定性等檢測。結果顯示,M77細胞株較普通MDCK細胞能顯著提高流感病毒滴度。將篩選到的細胞株建立MDCK細胞庫并進行細胞庫檢定,將篩選到的病毒株建立甲型H1N1流感病毒庫并進行病毒庫檢定,均符合要求。然后對病毒培養(yǎng)條件,包括細胞豐度、病毒稀釋液、病毒感染劑量(MOI)、培養(yǎng)溫度、病毒收獲時間等進行優(yōu)化。優(yōu)化的最佳培養(yǎng)條件為:接種病毒時細胞豐度選擇100%,采用無血清的DMEM培養(yǎng)基(含1μg/ml的TPCK-胰酶),MOI選擇0.001,培養(yǎng)溫度選擇37℃,病毒收獲時間選擇感染后72h～96h。以上條件優(yōu)化,為甲型H1N1流感病毒的擴大培養(yǎng)提供了技術保證。 第二、甲型H1N1流感病毒在MDCK細胞上的擴大培養(yǎng)、濃縮純化及檢測鑒定。將篩選到的甲型H1N1流感病毒株A/Beijing/501/2009感染篩選到的MDCK單克隆細胞株M77,采用優(yōu)化了的較佳培養(yǎng)條件,依次在細胞培養(yǎng)瓶、細胞工廠和發(fā)酵罐中進行擴大培養(yǎng),結果都較理想。將擴大培養(yǎng)收集的病毒收獲液通過1: 4000的甲醛滅活、10KD的膜包濃縮、30%與60%的蔗糖密度梯度離心純化、0.5%的Triton X-100裂解,并對純化前后的甲型H1N1病毒樣品進行電鏡觀察、血凝滴度、總蛋白含量、HA抗原含量、DNA殘留量等進行測定。結果顯示,經MDCK細胞培養(yǎng)的甲型H1N1流感病毒具典型流感病毒特征,純度達到98.3235%,雜蛋白去除率為98.30%,HA的回收率為40%,經處理后DNA殘留量低于100 pg/劑。 第三、細胞培養(yǎng)的甲型H1N1流感裂解疫苗的免疫效果評價。將由MDCK細胞培養(yǎng)的甲型H1N1流感病毒進行純化后,制備成甲型H1N1流感裂解疫苗。將6周齡的雌性Balb/c小鼠隨機分組,每組12只,分為PBS對照組、雞胚來源甲型H1N1流感裂解疫苗免疫組和細胞來源甲型H1N1流感裂解疫苗免疫組。每只小鼠肌肉注射接種HA抗原15μg,注射量為200μl/只。第一次免疫后兩周進行第二次加強免疫。分別在一免一周、一免二周、二免一周和二免二周對小鼠進行尾靜脈采血,檢測其血清中抗體IgG,IgG1,IgG 2a以及IgG 2b的滴度和HI滴度,并且檢測其血清中細胞因子IL-4和IFN-γ的滴度以及小鼠脾臟淋巴細胞中分泌IL-4和IFN-γ的細胞頻數(shù)水平。用甲型H1N1流感病毒株A/Beijing/501/2009和病毒株A/PR/8/34對二免二周的小鼠進行滴鼻攻毒實驗,評價細胞培養(yǎng)的甲型H1N1流感裂解疫苗對小鼠的免疫保護性及交叉保護性。結果顯示,細胞培養(yǎng)的甲型H1N1流感裂解疫苗與雞胚培養(yǎng)的甲型H1N1流感裂解疫苗都能激活較高的體液免疫水平,且細胞培養(yǎng)的甲型H1N1流感裂解疫苗比雞胚培養(yǎng)的甲型H1N1流感裂解疫苗要更高。細胞培養(yǎng)的甲型H1N1流感裂解疫苗和雞胚培養(yǎng)的甲型H1N1流感裂解疫苗對小鼠的免疫保護性都能達到100%。交叉保護性實驗顯示,細胞培養(yǎng)的甲型H1N1流感裂解疫苗比雞胚來源的流感裂解疫苗具有更好的交叉保護性。 結論:采用單克隆細胞株篩選的方法可以獲得能夠產生較高病毒滴度的細胞株,經病毒培養(yǎng)條件優(yōu)化后擴大培養(yǎng),可以獲得理想的病毒產量。經動物實驗證實細胞培養(yǎng)的甲型H1N1流感疫苗具有很好的免疫效果、較高的免疫保護性及交叉保護性。為發(fā)展MDCK細胞規(guī)模化生產流感疫苗奠定了基礎。
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【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：1373546