本文關(guān)鍵詞：同步檢測頭孢類抗生素與鏈霉素膠體金免疫層析法的建立　出處：《安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：頭孢類抗生素和鏈霉素都具有抗菌譜廣、殺菌能力強的特點，因而在獸醫(yī)臨床上被廣泛應(yīng)用于治療禽畜細(xì)菌感染等疾病，這兩類藥物又經(jīng)常聯(lián)用以增強治療效果，這樣增加禽畜機體內(nèi)藥物的殘留，通過食物鏈蓄積在人體內(nèi)，給人類的健康造成嚴(yán)重的危害。因此，為減少這兩類藥物殘留對人健康的危害，必須要加強對動物源性食品中這兩類藥物殘留的檢測，建立一種靈敏度高，操作簡便的方法具有十分重要的意義。 1.人工抗原的合成及多克隆抗體的制備 選取7-氨基頭孢烷酸（7-ACA）、頭孢拉定(CED)、頭孢氨芐(CEX)采用戊二醛法分別與牛血清蛋白（BSA）相結(jié)合制備免疫抗原、與卵清白蛋白（OVA）偶聯(lián)制備包被抗原。采用化學(xué)交聯(lián)法將鏈霉素（SM）分別與BSA和OVA偶聯(lián)制備免疫抗原SM-BSA與包被抗原SM-OVA。人工抗原經(jīng)紫外掃描和SDS-PAGE蛋白電泳鑒定陽性，紫外光譜掃描法計算7-ACA-BSA、CED-BSA、CEX-BSA以及SM-BSA結(jié)合比分別為14.34、15.62、12.29、15.21。用此四種抗原免疫新西蘭白兔得到抗血清，經(jīng)過ELISA測定抗血清效價，，抗7-ACA-BSA IgG、抗CED-BSA IgG、抗CEX-BSAIgG以及抗SM-BSAIgG的效價分別為：12800、64000、64000、64000。結(jié)果表明：偶合成功，結(jié)合比恰當(dāng)。所得抗血清效價符合實驗要求。 2.抗體交叉反應(yīng)性的測定 經(jīng)過優(yōu)化建立了間接ELISA的檢測方法，通過交叉反應(yīng)性的測定篩選出抗CEX-BSAIgG對頭孢類藥物有較好的交叉反應(yīng)性，交叉反應(yīng)率達(dá)到53.4%~101%，而抗SM IgG對硫酸鏈霉素及雙氫鏈霉素有較好的交叉反應(yīng)性交叉反應(yīng)率達(dá)到85%~101%。鏈霉素與頭孢類抗生素之間的交叉反應(yīng)率卻小于0.1%。因此選擇抗CEX-BSA IgG為研制檢測頭孢類抗生素試紙條的抗體。 3.金標(biāo)抗體的制備及單一檢測試紙條的制備 將純化后的抗體蛋白與制備的粒徑為18nm的膠體金相結(jié)合制備成金標(biāo)蛋白，并且對試紙條的組成材料和各條件進行優(yōu)化后，將試紙條各組分按順序組裝好，并對試紙條性能進行測試，頭孢氨芐檢測試紙條在PBS和牛奶基質(zhì)中對頭孢氨芐的最低檢測限分別為10ng/mL和80ng/mL，在牛奶基質(zhì)中對其他頭孢類抗生素的最低檢測限都在500ng/mL之內(nèi)；鏈霉素檢測試紙條在PBS和牛奶基質(zhì)中對鏈霉素的最低檢測限分別為150ng/mL和400ng/mL，牛奶基質(zhì)中對硫酸鏈霉素和雙氫鏈霉素的最低檢測限在1000ng/mL以內(nèi)。表明研制的試紙條的特異性和靈敏度等性能基本符合檢測要求。 4.雙元檢測試紙條的組裝及性能測定 將頭孢類抗生素及鏈霉素雙元檢測免疫層析試紙條組裝好，其在PBS及牛奶基質(zhì)中對頭孢氨芐的最低檢測限分別為20ng/mL和100ng/mL，對鏈霉素的最低檢測限分別為200ng/mL和500ng/mL。在牛奶中對其他β-內(nèi)酰胺類抗生素的最低檢測限都在1000ng/mL之內(nèi)；對雙氫鏈霉素和硫酸鏈霉素的檢測最低檢測線都在1000ng/mL之內(nèi)。表明研制的雙元檢測試紙條基本符合生產(chǎn)中用于檢測這兩類藥物殘留的要求。
[Abstract]:Both cephalosporins and streptomycin have wide antibacterial spectrum and strong bactericidal ability, so they are widely used in veterinary clinic to treat livestock bacterial infection and other diseases. These two kinds of drugs are often combined to enhance the therapeutic effect, so as to increase the residue of drugs in the livestock body, through the food chain accumulation in the human body, causing serious harm to human health. In order to reduce the harm to human health caused by these two kinds of drug residues, it is necessary to strengthen the detection of these two kinds of drug residues in animal-derived food. It is of great significance to establish a method with high sensitivity and simple operation. 1. Synthesis of artificial antigen and preparation of polyclonal antibody. The immune antigens were prepared by glutaraldehyde (Glutaraldehyde) method and bovine serum protein (BSA), respectively, in which 7-ACAA, CEDX, CEDX and CEDX were combined with bovine serum protein (BSA) by glutaraldehyde (Glutaraldehyde) method. The coated antigen was prepared by coupling with ovalbumin ovalbumin (OVA). Streptomycin (SMN) was prepared by chemical crosslinking method. Immune antigen SM-BSA and coated antigen SM-OVA were prepared by coupling with BSA and OVA respectively. The artificial antigen was identified by UV scanning and SDS-PAGE protein electrophoresis. The binding ratios of 7-ACA-BSAD-BSAD-BSAX-BSA and SM-BSA were 14.34 ~ 15.62 ~ 12.29, respectively. 15.21.The antiserum was obtained by immunizing New Zealand white rabbits with these four antigens. The titer of antiserum was determined by ELISA, and the antibody against 7-ACA-BSA IgG and anti-#en1# IgG was also determined. The titers of anti CEX-BSAIgG and anti SM-BSAIgG were: 1: 12800, 644000, 644000, respectively. The results showed that the coupling was successful. The titer of the antiserum obtained met the requirements of the experiment. 2. Determination of cross-reactivity of antibodies The indirect ELISA detection method was established by optimization, and the cross reactivity of anti CEX-BSAIgG to cephalosporins was screened out by cross reactivity determination. The cross reaction rate was 53.4% and 101%. And anti-SM. The cross reaction rate of IgG to streptomycin sulfate and dihydrostreptomycin reached 8510 1. The cross reaction rate between streptomycin and cephalosporins was less than 0.1. Anti CEX-BSA. IgG was used to develop an antibody for the detection of cefosporins. 3. Preparation of gold labeled antibody and preparation of single test strip The purified antibody protein was combined with the colloidal metal with the diameter of 18 nm to prepare the gold standard protein, and the composition and conditions of the test strip were optimized. The test strips were assembled in sequence, and the performance of the test strips was tested. The minimum detection limits of cefalexin in PBS and milk substrates were 10 ng / mL and 80 ng / mL, respectively. The minimum detection limit for other cephalosporins in milk substrates was within 500 ng / mL; The minimum detection limits for streptomycin in PBS and milk substrates were 150 ng / mL and 400 ng / mL, respectively. The minimum detection limit for streptomycin sulfate and dihydrostreptomycin in milk matrix is less than 1000 ng / mL, which indicates that the specificity and sensitivity of the test strip are basically in line with the detection requirements. 4. The assembly and performance measurement of duplex test strip The cefalexin and streptomycin double component immunochromatographic test strips were assembled. The minimum detection limits of cefalexin in PBS and milk matrix were 20 ng / mL and 100 ng / mL, respectively. The minimum detection limits for streptomycin were 200 ng / mL and 500 ng / mL, respectively. The minimum detection limits for other 尾 -lactam antibiotics in milk were within 1000 ng / mL. The minimum detection lines for both dihydrostreptomycin and streptomycin sulfate are within 1000 ng / mL. It is shown that the developed double-component test strip basically meets the requirements for the detection of the residue of these two kinds of drugs in production.
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R392

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本文編號：1372583