本文關(guān)鍵詞：表觀遺傳試劑應(yīng)用于截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌Pleurotus mutilus-04的初步研究　出處：《西南大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： Pleurotus mutilus-04 表觀遺傳修飾 伏立諾他 5-雜氮胞苷 次級代謝產(chǎn)物 截短側(cè)耳素

【摘要】：背景：隨著近些年來抗生素的過度使用,產(chǎn)生了很多耐藥菌,使人類對眾多常見疾病束手無策,因此尋找新型化合物促進藥物開發(fā)迫在眉睫。采用小分子酶抑制劑修飾真菌染色體的方法提供了一個快速有效的在其自身細(xì)胞內(nèi)挖掘真菌天然產(chǎn)物的方法,該方法不需要昂貴的儀器設(shè)備,可以廣泛的在許多實驗室中應(yīng)用,成本較低,不需要較大工作量且對真菌的遺傳背景無過高要求。隨著近些年來表觀遺傳學(xué)研究的深入,真菌的表觀遺傳修飾研究逐漸成為熱點。表觀遺傳學(xué)就是指在染色體中DNA序列不發(fā)生變化的情況下,基因表達卻發(fā)生了可遺傳的改變,其分子機制主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑以及RNA干擾等幾個方面,在真菌中研究比較多的就是DNA甲基化、組蛋白甲基化和乙酰化。目前,真菌的表觀遺傳研究手段主要是過表達或缺失相關(guān)表觀修飾基因或利用小分子表觀遺傳試劑兩個方面。真菌進行表觀遺傳修飾可能會改變真菌的次級代謝產(chǎn)物譜,不僅可以提高多種已知次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量,而且可以激活沉默生物合成基因簇產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物。 目的：本實驗主要通過兩種小分子表觀遺傳試劑伏立諾他(suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA)—組蛋白去乙酰化試劑和5-雜氮胞苷—DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑來對一株能夠產(chǎn)生截短側(cè)耳素的大型擔(dān)子綱真菌Pleurotus mutilus-04進行菌種改良。觀察小分子表觀遺傳試劑作用P utilus-04后,其菌落、菌絲形態(tài)的變化以及其次級代謝產(chǎn)物譜的變化。 方法：本實驗通過96孔板方法測定兩種表觀遺傳試劑的MIC值。P.mutilus-04接種一天后加入2倍MIC表觀遺傳試劑,發(fā)酵培養(yǎng)7天后,使用顯微鏡對其菌絲進行觀察,采用高效液相色譜對其次級代謝產(chǎn)物進行分析,并使用制備型高效液相色譜對化合物進行分離,最后利用核磁共振儀及質(zhì)譜儀對化合物進行結(jié)構(gòu)解析。 結(jié)果：研究發(fā)現(xiàn)伏立諾他作用P.mutilus-04后,胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了化合物A,進行了紫外波普掃描以及質(zhì)譜分析,確定其為新化合物A；在其發(fā)酵液中分離得到了伏立諾他的結(jié)構(gòu)類似物-化合物D,活性檢測發(fā)現(xiàn)化合物D的抗癌活性明顯低于伏立諾他。伏立諾他實驗組菌體中截短側(cè)耳素的產(chǎn)量相對于陰性對照組中截短側(cè)耳素的產(chǎn)量下降了六倍,而5-雜氮胞苷實驗組中截短側(cè)耳素的產(chǎn)量相對于陰性對照組中截短側(cè)耳素的產(chǎn)量沒有較大變化。雖然5-雜氮胞苷對P.mutilus-04的次級代謝產(chǎn)物沒有明顯的影響,但其對P.mutilus-04的菌落形態(tài)有較明顯的影響,經(jīng)5-雜氮胞苷處理后的P.mutilus-04,菌落半徑較大,菌絲稀疏。 結(jié)論：伏立諾他和5-雜氮胞苷兩種表觀遺傳試劑對大型擔(dān)子綱真菌P.mutilus-04的菌落、菌絲形態(tài),次級代謝產(chǎn)物等方面有不同程度的影響,證明這種快捷簡便的方法不僅可以在青霉曲霉中,也可以在大型擔(dān)子綱真菌中進行菌種改良,驗證了這種方法的應(yīng)用廣泛性。
[Abstract]:Background: with the excessive use of antibiotics in recent years, produced a lot of resistant bacteria to humans for many common diseases, so to find new compounds at a loss what to do, to promote the development of small molecule drugs imminent. Methods using the modified enzyme inhibitor of fungal chromosome provides a fast and effective mining fungal natural products in its own cell method, this method don't need expensive equipment, can be widely used in many laboratories, low cost, does not need a large workload and genetic background of fungi with no high requirements. In recent years epigenetic research, fungal epigenetic modification research has become a hot topic. Epigenetics refers to the chromosome in the DNA sequence does not change under the condition of gene expression has undergone genetic changes, including DNA methylation and its molecular mechanism, egg group The white modification, chromatin remodeling and RNA interference in several aspects such as research in fungi is much DNA methylation, histone methylation and acetylation. At present, the concept of genetic research means of fungal overexpression or deletion is mainly related to epigenetic modification of genes or by small molecule epigenetic reagent two aspects the secondary metabolites of fungi. Epigenetic modifications may alter the fungal spectrum, not only can improve many known secondary metabolites production, but also can activate silent biosynthetic gene clusters produced new metabolic products.
Objective: this experiment mainly through two kinds of small molecular epigenetic reagent vorinostat (suberoylanilide hydroxamic, acid, SAHA) - histone acetylation reagent and 5- azacytidine - DNA methyltransferase inhibitor to a strain capable of producing pleuromutilins large burden Pleurotus mutilus-04 phylum of fungi strain improvement was observed. Small molecular epigenetic reagents P utilus-04, the colony and mycelial morphology changes, changes in the secondary metabolic product spectrum.
Methods: this experiment by 96 hole plate method for the determination of two epigenetic reagent MIC value.P.mutilus-04 a day after inoculation with 2 times MIC epigenetic reagent, fermentation for 7 days, using a microscope to observe the mycelium by HPLC on the secondary metabolites, and use the preparation high performance liquid chromatography for separation of compounds, finally using NMR and mass spectrometry to analyze the structure of compounds.
Results: the study found that vorinostat P.mutilus-04, discovered the compound A intracellular by UV scanning and pop spectrum analysis, to determine the new compound A; isolated vorinostat analogues - compound D in fermentation broth, the activity detection of the anticancer activity of D compounds was significantly lower than that of vorinostat. Vorinostat experimental pleuromutilin yield relative to the yield of pleuromutilin negative control group decreased six times group of bacteria, while 5- azacytidine in experimental group pleuromutilin yield relative to the yield of pleuromutilin negative control group did not change. Although 5- complex secondary metabolites of 5-azacytidine on P.mutilus-04 had no significant effect, but has obvious effect on P.mutilus-04 colony morphology by 5- azacytidine treated P.mutilus-04, bacteria colony radius is large, thin wire Sparse.
Conclusion: vorinostat and 5- azacytidine two apparent colony genetic reagents on the large burden P.mutilus-04 phylum of fungi mycelial morphology, have different effects on the secondary metabolites, proved that this method can not only convenient in Penicillium Aspergillus, can also strain improvement in large burden in the phylum of fungi and verify the application of this method widely.

【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R378

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