本文關鍵詞：鮑曼不動桿菌外膜蛋白A真核表達載體構(gòu)建及其誘導Hela細胞不完全自噬　出處：《免疫學雜志》2017年11期 　論文類型：期刊論文

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【摘要】：目的構(gòu)建鮑曼不動桿菌ATCC19606(Acinetobacter baumannii ATCC 19606)外膜蛋白A(outer membrane protein A,OmpA)的真核表達載體pEGFP-OmpA,研究OmpA對Hela細胞自噬的影響。方法采用PCR方法擴增鮑曼不動桿菌ATCC19606的OmpA基因,將其克隆至真核表達載體pEGFP-N1,以構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-OmpA;用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其轉(zhuǎn)染Hela細胞;流式細胞術、細胞免疫熒光和Western blot檢測OmpA表達水平;激光共聚焦顯微鏡檢測OmpA在Hela細胞中的定位;Western blot及透射電子顯微鏡檢測OmpA對Hela細胞自噬的影響。結(jié)果經(jīng)雙酶切及測序鑒定表明pEGFP-OmpA質(zhì)粒構(gòu)建成功;OmpA可以大量表達于Hela細胞的細胞質(zhì)和細胞核中;OmpA可導致Hela細胞中自噬相關蛋白LC3BⅡ、p62和Beclin-1表達升高,而且在Hela細胞中發(fā)現(xiàn)自噬小體;OmpA會干擾p62降解,引發(fā)不完全自噬。結(jié)論本研究成功構(gòu)建pEGFP-OmpA真核表達載體,它可以在Hela細胞中高效表達,并可導致Hela細胞不完全自噬,這為將來進一步研究鮑曼不動桿菌OmpA引起自噬的機制奠定基礎。
[Abstract]:Objective to construct Bauman Acinetobacter ATCC19606 (Acinetobacter baumannii ATCC A (19606) outer membrane protein outer membrane protein A, OmpA) the eukaryotic expression vector pEGFP-OmpA. The effects of OmpA on autophagy in Hela cells. Methods OmpA gene amplification Bauman real coli ATCC19606 by PCR method, then cloned into eukaryotic expression vector pEGFP-N1. To construct the recombinant plasmid pEGFP-OmpA; liposome transfected into Hela cells; flow cytometry, cell immunofluorescence and Western blot detected the expression level of OmpA; detection OmpA laser scanning confocal microscope in Hela cells; OmpA Western blot influence the detection and transmission electron microscopy of autophagy in Hela cells. Results the double enzyme digestion and sequencing showed that the pEGFP-OmpA plasmid was successfully constructed; OmpA can be expressed in Hela cell cytoplasm and nucleus; OmpA can induce Hela cell autophagy. Protein LC3B II, p62 and Beclin-1 expression increased, and that of autophagosomes in Hela cells; OmpA may interfere with the degradation of p62, caused by incomplete autophagy. Conclusion this study has successfully constructed the eukaryotic expression vector pEGFP-OmpA, which can be efficiently expressed in Hela cells, and Hela cells can lead to incomplete autophagy, which for the future further study of Bauman Acinetobacter OmpA autophagy mechanism caused by the foundation.

【作者單位】： 首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院醫(yī)學研究中心;中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科;
【分類號】：R378
【正文快照】： 鮑曼不動桿菌是一種非發(fā)酵的革蘭氏陰性條件致病菌,它通常感染免疫力低下的人群,可以導致肺炎、菌血癥、泌尿系感染、腦膜炎等感染性疾病[1]。近年來,由于抗生素的濫用,產(chǎn)生了耐碳青霉烯的鮑曼不動桿菌,甚至出現(xiàn)了泛耐藥和全耐藥鮑曼不動桿菌,這給臨床治療帶來了極大困難[2]。

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