本文關(guān)鍵詞：日本血吸蟲性激素相關(guān)受體EsRRBL1和PGMRC2的初步研究　出處：《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：日本血吸蟲�。⊿chistosomiasis japonicum）是由日本血吸蟲（Schistosome japonicum）感染所引起的一種嚴(yán)重危害人畜健康的寄生蟲病。日本血吸蟲可感染人等40余種哺乳動(dòng)物，但不同宿主對(duì)血吸蟲的適宜性存在較大差異。血吸蟲基因組研究表明該寄生蟲具有編碼激素的受體，并形成完整的激素通道，可以利用宿主激素促進(jìn)自身的生長(zhǎng)發(fā)育和成熟。本課題組近期研究表明，一些不同適宜性宿主來源血吸蟲蟲體中差異表達(dá)的基因或者蛋白可能對(duì)血吸蟲生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。本研究在不同宿主來源10d血吸蟲童蟲基因芯片研究的基礎(chǔ)上，選取了在血吸蟲抗性宿主東方田鼠來源童蟲中呈顯著低表達(dá)的兩個(gè)日本血吸蟲性激素相關(guān)新基因——雌激素相關(guān)受體β類似物1（SjEsRRBL1）和膜相關(guān)的孕酮受體組件2（SjPGMRC2），開展了以下研究。 1.宿主性別對(duì)于血吸蟲生長(zhǎng)發(fā)育的影響 采用同一周齡、不同性別的BABL/c小鼠，在同一時(shí)間、同一條件下感染同一批釘螺逸出的尾蚴，對(duì)不同性別宿主來源的日本血吸蟲成蟲的發(fā)育情況及蟲體大小進(jìn)行了兩次實(shí)驗(yàn)觀察。初步結(jié)果表明，雌性小鼠中血吸蟲的發(fā)育率（56.5%和64.1%）顯著高于雄性小鼠（40.8%和47%），差異顯著(P＜0.01），同時(shí)雌鼠來源的雌、雄蟲體都比雄鼠來源的雌、雄蟲體略大一些，但差異不顯著。 2.日本血吸蟲雌激素相關(guān)受體β類似物1（EsRRBLI）的研究 利用PCR技術(shù)首次擴(kuò)增獲得SjEsRRBL（1JQ612589）的全長(zhǎng)cDNA序列，其開放閱讀框（ORF）為1374bp,編碼458個(gè)氨基酸，理論分子量是52.2kDa，理論等電點(diǎn)是4.71。構(gòu)建了pET32a-SjEsRRBLI重組表達(dá)質(zhì)粒，并在大腸桿菌中成功表達(dá)，重組蛋白以包涵體的形式存在，分子量大小為72kDa。實(shí)時(shí)定量PCR和western blotting分析都表明SjEsRRBL1在檢測(cè)的血吸蟲童蟲和成蟲各個(gè)發(fā)育階段都有轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，其中在14d、18d、23d和28d的血吸蟲中轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平較35d和42d蟲體高。同時(shí)SjEsRRBL1在血吸蟲抗性宿主東方田鼠來源蟲體中表達(dá)量顯著低于易感性宿主BABL/c小鼠來源蟲體，在雌性小鼠來源蟲體中表達(dá)量要高于在雄性小鼠來源蟲體中的表達(dá)量。Western blotting分析表明重組蛋白rSjEsRRBL1具有較好的抗原性和免疫原性，rSjEsRRBL1免疫鼠血清能特異性識(shí)別血吸蟲蟲體中的天然蛋白。兩次動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明rSjEsRRBL1在BALB/c小鼠中分別誘導(dǎo)了30.84%和30.70%的減蟲率(P 0.01)及32.59%和35.61%的減卵率(P0.01)，說明該重組蛋白能夠在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)部分免疫保護(hù)效果。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明一免后小鼠即產(chǎn)生了抗重組蛋白SjEsRRBL1的特異性IgG抗體，并且一直維持在一個(gè)較高的水平。細(xì)胞免疫和體液免疫分析結(jié)果表明，rSjEsRRBL1結(jié)合206佐劑免疫小鼠后誘導(dǎo)了Th1/Th2混合型并以Th1型占主導(dǎo)的免疫反應(yīng)。本研究表明SjEsRRBL1可能在日本血吸蟲的生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要的作用。 3.日本血吸蟲膜相關(guān)的孕酮受體組件2（PGMRC2）的研究 利用PCR技術(shù)首次擴(kuò)增獲得SjPGMRC2（FN317689.1）去除信號(hào)肽的部分cDNA序列，大小為480bp,編碼160個(gè)氨基酸，理論分子量為18162.55Da，理論等電點(diǎn)為6.12。構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-SjPGMRC2，并在大腸桿菌中成功表達(dá)，重組蛋白可溶性表達(dá)，分子量為38kDa。實(shí)時(shí)定量PCR分析表明SjPGMRC2在檢測(cè)的血吸蟲童蟲和成蟲各個(gè)發(fā)育階段都有轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，在18d和23d血吸蟲中轉(zhuǎn)錄水平較高。SjPGMRC2在血吸蟲抗性宿主東方田鼠來源蟲體中表達(dá)量顯著低于易感性宿主BABL/c小鼠來源蟲體，在雌性小鼠來源蟲體中表達(dá)量要高于在雄性小鼠來源蟲體中的表達(dá)量。Western blotting分析結(jié)果表明重組蛋白rSjPGMRC2具有較好的抗原性和免疫原性。兩次動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重組蛋白SjPGMRC2在BALB/c小鼠中分別誘導(dǎo)了22.08%和20.097%的減蟲率(P 0.01)，表明重組蛋白SjEsRRBL1能夠在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)部分免疫保護(hù)效果。特異性抗體及淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子的測(cè)定結(jié)果表明，rSjPGMRC2結(jié)合206佐劑免疫小鼠后誘導(dǎo)了Th1/Th2混合型并以Th1型占主導(dǎo)的免疫反應(yīng)。篩選獲得特異性針對(duì)SjPGMRC2的siRNA，利用該siRNA在小鼠體內(nèi)對(duì)SjPGMRC2基因進(jìn)行特異性干擾，獲得24%的減蟲率。本研究表明SjPGMRC2可能對(duì)日本血吸蟲生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用。 本研究首次對(duì)兩個(gè)性激素相關(guān)的日本血吸蟲新基因SjEsRRBL1和SjPGMRC2進(jìn)行了克隆、表達(dá)，分析了這兩個(gè)基因在不同適宜性宿主、不同性別宿主以及不同發(fā)育階段蟲體中的表達(dá)情況，評(píng)估了其在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫保護(hù)效果，，分析了其誘導(dǎo)的免疫機(jī)制。本文為深入探討宿主性別和不同激素環(huán)境對(duì)于血吸蟲生長(zhǎng)發(fā)育的影響提供了重要信息，為篩選日本血吸蟲新的疫苗候選分子和藥靶標(biāo)提供了重要基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1351623