發(fā)布時(shí)間：2017-12-29 08:22

  本文關(guān)鍵詞：嗜水氣單胞菌外膜蛋白微球口服疫苗制備及動(dòng)物免疫效果評(píng)價(jià)　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)是一種水體環(huán)境中廣泛分布的重要病原菌,可引發(fā)魚類、兩棲類動(dòng)物的致死性疾病,給淡水養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。該菌也可通過水產(chǎn)動(dòng)物感染人畜,威脅人畜健康。因此,在水產(chǎn)養(yǎng)殖中,對(duì)嗜水氣單胞菌感染的防控具有重要意義。 口服疫苗用于動(dòng)物免疫,優(yōu)點(diǎn)突出,動(dòng)物應(yīng)激小,易于大規(guī)模免疫。口服接種疫苗較之傳統(tǒng)接種方式還存在一些潛在優(yōu)勢(shì),它提高了疫苗的穩(wěn)定性和安全性,延長(zhǎng)了疫苗的保存期限,具有良好的應(yīng)用前景。 本文使用實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的嗜水氣單胞菌外膜蛋白重組菌,優(yōu)化外膜蛋白表達(dá)條件。研究發(fā)現(xiàn),在LB培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)重組菌至OD值0.8,以1.0mmol/L的IPTG在28℃誘導(dǎo)工程菌4.5-5h,外膜蛋白表達(dá)量最高。在此條件下大量制備該蛋白,以蛋白為芯材,以生物相容性良好的海藻酸鈉為壁材,最外層包覆殼聚糖,制備微球口服疫苗。通過改進(jìn)微球化方法,結(jié)合噴霧、二價(jià)離子溶液收集成型(液相-凝膠轉(zhuǎn)化)、高速勻漿包裹、保護(hù)劑冷凍干燥等方法優(yōu)化制備工藝。通過四因素三水平正交試驗(yàn),確定了CaCl2濃度0.5%、攪拌速度1200rpm、進(jìn)料速度15mL/min、海藻酸鈉濃度2.0%等微球制備條件。所得微球包封率83.07%,pH7.4 PBS膨脹率559.36%,8.5%NaCl膨脹率605.89%,蒸餾水膨脹率652.01%,載蛋白量0.5786mg/10mg,酸堿條件釋放能力符合試驗(yàn)需要,飼喂安全性良好,貯存穩(wěn)定性良好。以該工藝制備的微球具備預(yù)期理化性質(zhì),實(shí)現(xiàn)了所需微球口服疫苗的優(yōu)化制備。 為評(píng)價(jià)嗜水氣單胞菌外膜蛋白亞單位微球口服疫苗(OMP-MS)的免疫效果,本研究以優(yōu)化的條件制備口服疫苗,采用不同劑量注射或灌胃免疫小鼠,利用熒光定量PCR (RT-PCR)、酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)(ELISA)、組織石蠟切片制備等方法,分析血清抗體、腸黏膜抗體、回腸集合淋巴小結(jié)等的變化,并借助免疫保護(hù)試驗(yàn)評(píng)價(jià)免疫效果。結(jié)果表明,各口服免疫組(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)腸黏膜sIgA水平顯著高于對(duì)照組(Ⅵ、Ⅶ組)和注射免疫組(Ⅰ組)(P0.05),提示口服免疫誘導(dǎo)了局部的特異性免疫,而血清IgG水平低于注射免疫組,但仍高于對(duì)照組；熒光定量PCR分析,口服免疫組和注射免疫組細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4 mRNA表達(dá)在免疫后上調(diào)；口服免疫組回腸集合淋巴小結(jié)數(shù)目增多,體積增大,這些都提示疫苗刺激并增強(qiáng)了機(jī)體免疫反應(yīng)；免疫保護(hù)試驗(yàn)顯示,滅活菌注射組和微球口服組,低、中、高劑量外膜蛋白微球口服組分別獲得了50.00%(4/8)、50.00%(3/6)、33.33%(3/9)、75%(6/8)和33.33%(3/9)的相對(duì)保護(hù)率,說明中劑量外膜蛋白微球口服免疫小鼠,可獲得較好的免疫保護(hù)效果。 在池塘網(wǎng)箱養(yǎng)殖條件下馴化鳊魚,分別用嗜水氣單胞菌全菌疫苗和外膜蛋白疫苗進(jìn)行注射和口服免疫。免疫后每周取血清、后腸腸段,檢測(cè)血清/黏液抗體、血清溶菌酶(LSZ)活性、血清SOD活性,并檢測(cè)頭腎細(xì)胞吞噬活性,在第45天進(jìn)行免疫保護(hù)試驗(yàn)。結(jié)果顯示：免疫后期,口服免疫組(Ⅲ、Ⅳ組)血清/后腸黏液IgM抗體水平顯著高于注射免疫組(Ⅰ、Ⅱ組)(P0.05),滅活菌微球口服免疫組(Ⅲ組)與外膜蛋白微球口服免疫組(Ⅳ組)差異不顯著(P0.05)；43d口服免疫組體表黏液IgM抗體檢出率高于注射免疫組。各免疫組血清溶菌酶(LSZ)活性、SOD活性在免疫期內(nèi)波動(dòng)上升,免疫后期顯著升高。45d進(jìn)行的免疫保護(hù)試驗(yàn)顯示,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組分別獲得了50.00%(16/30)、55.67%(17/30)、25.00%(9/30)、21.43%(8/30)的相對(duì)保護(hù)率。說明,制備的嗜水氣單胞菌外膜蛋白口服疫苗免疫鳊魚具備一定的免疫保護(hù)作用,但免疫效果低于注射免疫。 綜上所述,優(yōu)化制備的嗜水氣單胞菌外膜蛋白口服疫苗免疫小鼠、鳊魚,免疫效果分析證實(shí)疫苗誘導(dǎo)了試驗(yàn)動(dòng)物的免疫應(yīng)答,產(chǎn)生了一定的免疫保護(hù)效果。研究為基因工程亞單位口服疫苗用于淡水養(yǎng)殖業(yè)的疾病預(yù)防提供了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1349516