本文關鍵詞：金黃色葡萄球菌PV-殺白細胞素（PVL）對多形核粒細胞的影響　出處：《安徽醫(yī)科大學》2011年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的:耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)是危害人民生命健康的超級細菌,產(chǎn)PV-殺白細胞毒素(PVL)的MRSA毒力增強,危害更廣,可引起社區(qū)人群的嚴重感染。臨床研究發(fā)現(xiàn),產(chǎn)PVL的MRSA所引起的壞死性肺炎病情進展快,治療困難,死亡率高,常伴有多核形粒細胞(PMNs)在呼吸道表面聚集,發(fā)生嚴重的炎癥反應,但其機制尚不清楚。本課題將誘導含重組表達載體的宿主菌表達,純化獲得重組PVL蛋白(rPVL),觀察rPVL對人PMNs的殺傷作用,探討rPVL對PMNs細胞因子IL-6、IL-8和TNF-α表達的影響,并探討其胞內(nèi)信號傳導通路,同時研究rPVL對不同種屬來源的PMNs的殺傷作用,為闡釋PVL的致病機制,尋求治療PVL相關肺損傷的新靶點提供理論依據(jù)。 方法:(1)異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)誘導含重組表達載體的大腸埃希菌(E.coli) BL21(DE3)株,純化后獲得可溶性重組蛋白,Western blot對其鑒定。(2)從正常人外周血分離PMNs,分別加入6nmol/L,100nmol/L rPVL蛋白,共同孵育6h,臺盼蘭染色觀察細胞活力,瑞氏吉姆薩染色觀察細胞形態(tài),透射電子顯微鏡觀察細胞超微結構,流式細胞法檢測細胞凋亡/壞死率。同時,分離人、新西蘭白兔、BALB/c小鼠、C57/ BL6小鼠的PMNs,分別加入PBS和20nmol/L rPVL蛋白,共同孵育4h,臺盼蘭染色觀察細胞活力,瑞氏吉姆薩染色觀察細胞形態(tài),流式細胞法檢測細胞凋亡/壞死率。(3)收集細胞,提取總RNA,應用RT-PCR法檢測細胞IL-6、IL-8、TNF-α、TLR2、TLR4、CD14 CXCR4及NF-κB p65 mRNA表達。同時收集細胞培養(yǎng)上清,ELISA法檢測IL-6、IL-8及TNF-α濃度變化。 結果:(1)經(jīng)IPTG誘導后, SDS-PAGE鑒定可獲得到與預期分子量相符的表達產(chǎn)物。親和層析法純化的rPVL-F和rPVL-S,經(jīng)Western-blotting鑒定,能夠被鼠源性抗His抗體識別。(2)rPVL作用后,臺盼蘭染色可見人、新西蘭白兔及BALB/c小鼠的PMNs著色細胞增多,瑞氏吉姆薩染色可見細胞中出現(xiàn)不規(guī)則團塊樣物,核固縮,細胞形態(tài)縮小,部分細胞胞漿可見空泡,核碎裂。電鏡檢查可見rPVL作用后,細胞核固縮,胞漿空泡增多,并可見凋亡小體。流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn),相較之于PBS對照組,rPVL組細胞凋亡率和壞死率均明顯升高,具有統(tǒng)計學意義。而C57/BL6小鼠的PMNs在rPVL作用前后,細胞活力、形態(tài)學及凋亡和壞死率均無變化。(3)rPVL作用PMNs后,細胞因子IL-6、IL-8及TNF-α濃度及mRNA表達量明顯增加,且隨著濃度升高,增加更為明顯。PMNs TLR2、TLR4及其相關信號通路分子CD14、CXCR4 mRNA表達量均增高。同時,PMNs NF-κB p65 mRNA表達量也明顯增高。 結論:(1)成功建立了PVL基因高效表達體系,經(jīng)親和層析純化法可獲得重組蛋白,為研究PVL分子致病機制奠定基礎。(2)rPVL對人PMNs具有特異性殺傷作用,可誘導PMNs凋亡,甚至壞死,使得細胞活力減低,形態(tài)改變。同時,對不同種屬來源的PMNs,顯示出不同的殺傷作用。(3)rPVL能促進PMNs細胞因子IL-6、IL-8及TNF-α的表達,同時,可上調(diào)PMNs TLR2、TLR4表達,提示rPVL可通過TLR信號傳導通路,促進NF-κB活化,進而促進細胞因子的表達和分泌。
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【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R378

【引證文獻】

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1 張翠萍;P-V殺白細胞素相關肺損傷的炎癥機制研究[D];安徽醫(yī)科大學;2012年

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本文編號：1347904