發(fā)布時間：2017-12-28 00:36

  本文關鍵詞：磷硫酰化DNA在細菌中作為抗氧化劑的機制研究　出處：《上海交通大學》2012年博士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： DNA降解 磷硫�；疍NA 過氧乙酸 氫膦酸酯化DNA 氧化切割機制 過氧化氫 抗氧化劑 氧化壓力

【摘要】：在細菌的DNA上進行磷硫酰化修飾（硫修飾），而硫修飾DNA在電泳過程中發(fā)生降解表型(DNA degradation，Dnd)。負責這種磷硫酰化修飾功能的蛋白由5個連鎖并存在于一個基因組島上的5個基因dndA-E編碼，其中四個基因dndA和dndC-E是磷硫酰化修飾所必需的基因。而對于生理學意義直到最近，才在天藍色鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)了特異地限制磷硫�；疍NA的基因，在沙門氏菌中發(fā)現(xiàn)了磷硫�；揎椣拗葡到y(tǒng)。到目前為止磷硫�；揎桪NA電泳過程中降解機制不明，且其生理學意義知之甚少。 用化學合成的模擬底物磷硫酰化修飾的二核苷dG~SA和PAA-TAE激活液反應，作為研究磷硫酰化DNA電泳過程中降解機制的模擬反應，產(chǎn)物在HPLC圖譜上顯示6個新的UV_(254nm)吸收峰。PAA-TAE激活液的化學組成包括了過氧化氫、過氧乙酸、乙酸、Tris堿和乙二胺四乙酸（EDTA）。將各個組分解離開來分析，其中PAA能夠直接將去離子水中的dG~SA氧化切割生成6個產(chǎn)物（化合物2-7），，不需要Tris等一級胺的參與。在不同pH的Tris溶液中用PAA氧化切割dG~SA，得到各個氧化切割產(chǎn)物的比例是不一樣的。在1%乙酸溶液中用PAA處理dG~SA，可以得到高比例的過渡態(tài)氫膦酸酯化的二核苷dG~HA（化合物2），這為后續(xù)很多實驗奠定了基礎。 通過高分辨質譜的數(shù)據(jù)分析得到各個化合物的精確分子量和可能的化學分子式，再根據(jù)各個化合物斷裂后形成的離子碎片與原結構的比較，初步推測了化合物2-7的可能結構。根據(jù)推測的結構，利用化學合成的標準品與各個化合物的HPLC保留時間、紫外吸收特征、質譜、二級質譜等特性的比較，最終確定了各個氧化切割產(chǎn)物的具體結構。化合物2是腺嘌呤鳥嘌呤脫氧核糖核苷二核苷的氫膦酸二酯dG~HA，化合物3是正常的二核苷酸dG~OA，化合物4是帶有鳥嘌呤脫氧核糖核苷的氫膦酸單酯，化合物5是腺嘌呤脫氧核糖核苷，化合物6是鳥嘌呤脫氧核糖核苷，化合物7是帶有腺嘌呤脫氧核糖核苷的氫膦酸單酯。 通過在酸性環(huán)境下制得高比例的過渡態(tài)化合物2，然后將反應液冷凍干燥，再溶解在不同pH溶液中進行HPLC-MS檢測，在pH5.0的條件下氫膦酸二核苷dG~HA發(fā)生水解斷裂，最終提出了磷硫�；疍NA被PAA通過先氧化再水解的兩步降解機制。用磷硫�；阴プ鳛榈孜锖蚉AA或者過氧化氫反應，反應液經(jīng)冷凍干燥后發(fā)現(xiàn)有刺激氣味的黃色物質產(chǎn)生，用GC-MS確定了該物質是單質硫。在酸性條件下制得了高比例的氫膦酸酯化的二核苷dG~HA，然后用Tris堿迅速調節(jié)pH到7.0，發(fā)現(xiàn)有大量的氫膦酸酯化的二核苷轉化到正常的二核苷。而磷硫酰化的基因組DNA也具有類似的現(xiàn)象，當PAA處理后的樣品迅速調pH之后DNA降解現(xiàn)象急劇減弱甚至消失。過氧化氫也能夠和磷硫�；疍NA直接發(fā)生反應，并將磷硫�；疍NA氧化到正常狀態(tài)的磷酸酯DNA或使其氧化損傷斷裂。 最終提出磷硫�；疍NA在電泳過程中發(fā)生的化學反應即降解機制，磷硫�；疍NA的最終命運有兩種可能性，一種是磷硫�；疍NA可以在PAA等氧化劑的作用直接氧化到正常的DNA，或者先被氧化到氫膦酸酯然后再被氧化到正常的DNA而不會引起磷硫�；疍NA斷裂降解；另一種是磷硫�；疍NA被PAA氧化到氫膦酸酯的DNA，然后被水解而表現(xiàn)為磷硫�；疍NA電泳過程中的降解。 當用不同濃度的磷硫�；塑誨G~SA與過氧化氫反應，HPLC檢測反應后剩余的過氧化氫量，磷硫�；痙G~SA量的增加可明顯地消耗更多的過氧化氫，而正常的磷酸酯化的二核苷dG~OA則不能夠消耗過氧化氫，證明磷硫�；疍NA能夠作為還原劑消耗過氧化氫。用不同濃度的過氧化氫或過氧乙酸與磷硫�；疍NA反應，發(fā)現(xiàn)在0.14mM PAA作用下就有正常的二核苷dG~OA生成，而利用MS的高精度特性可以在10μM PAA存在下檢測到dG~OA生成。暗示生理氧化壓力條件下，磷硫酰化的DNA可以作為抗氧化劑消耗過氧化氫而減小氧化壓力對生物體的影響。過氧化氫處理含有和缺失磷硫�；疍NA的沙門氏菌株，生長曲線顯示含有磷硫�；揎桪NA的野生型、dptＢ缺失突變株能夠在較高濃度的過氧化氫環(huán)境下生長，而缺失了磷硫酰化修飾DNA的dptＣ、Ｄ、Ｅ突變菌株則不能夠在較高濃度的過氧化氫環(huán)境下生長。這就證明磷硫酰化修飾的DNA賦予了微生物抵抗一定量的過氧化氫的能力。 用不同濃度的過氧化氫處理含有或缺失磷硫酰化DNA的沙門氏菌株，提取總基因組DNA電泳檢測，磷硫�；疍NA的菌株在一定濃度的過氧化氫處理后其DNA保存的比較完整，但缺失磷硫�；疍NA的菌株其DNA發(fā)生了明顯的雙鏈斷裂現(xiàn)象。表明磷硫�；疍NA在體內要比非磷硫酰化DNA更加耐受氧化壓力造成的氧化損傷。用Dnd現(xiàn)象檢測DNA磷硫酰化修飾豐度變化表明，磷硫酰化修飾豐度在一定濃度的過氧化氫處理后明顯地降低。但同時在一定濃度條件下檢測不到明顯的變化，可能是因為活性氧分子將磷硫�；疍NA轉化為正常的磷酸酯化DNA，然后在宿主dpt相關基因編碼蛋白的作用下重新進行了磷硫�；揎棥� 自然界的沙門氏菌含有磷硫�；揎桪NA，能夠作為抗氧化劑抵抗一定的氧化壓力。當將編碼沙門氏菌的整個dpt基因簇質粒轉化到大腸桿菌DH10B中，賦予新宿主菌以磷硫�；揎桪NA的特性，增加了宿主菌對抗過氧化氫的能力。證明磷硫酰化DNA可以給細菌帶來抗氧化壓力的能力，也可以解釋為什么編碼磷硫�；揎桪NA的基因處于一個基因組島上，使其能夠在微生物間進行水平轉移然后賦予新宿主以抵抗氧化壓力的能力。 綜上所述，磷硫�；疍NA在電泳過程中降解主要是因為被過氧化物氧化生成氫膦酸酯化DNA，然后發(fā)生水解而斷裂；磷硫酰化DNA能夠作為抗氧化劑保護DNA免受氧化損傷，并消除一部分的氧化壓力，從而提高宿主菌在氧化壓力下的生存能力。
[Abstract]:Phosphorothioylation modification (sulfur modified) on the DNA of bacteria, while sulfur modified DNA has a degradation phenotype (DNA degradation, Dnd) during the electrophoresis. The protein responsible for this phosphorylation and thiylation modification is encoded by 5 dndA-E genes linked to 5 genes on a genomic island, of which four genes dndA and dndC-E are necessary genes for phospho thioylation. For physiological significance, until recently, a gene that specifically phosphorylated DNA was found in Streptomyces sky blue, and a phosphorylthioylation modification system was found in Salmonella. So far, the mechanism of degradation of phosphonothioylated DNA electrophoresis is unknown, and its physiological significance is very little.
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R378

【參考文獻】

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1 梁晶丹;汪志軍;周秀芬;鄧子新;;過氧乙酸-TAE緩沖液對硫修飾DNA切割條件的優(yōu)化[J];上海交通大學學報;2008年01期

2 鄧大君,鄧國仁,呂有勇,周靜,辛慧君;變性高效液相色譜法檢測CpG島胞嘧啶甲基化[J];中華醫(yī)學雜志;2001年03期

3 陸嶸,房靜遠,朱紅音,陳縈fE,程中華,李恩靈;甲基轉移酶1表達質粒對結腸癌細胞錯配修復基因甲基化及其表達的影響[J];中華醫(yī)學雜志;2004年12期

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1 李愛英;變鉛青鏈霉菌DNA異常修飾系統(tǒng)的分子生物學研究[D];華中農業(yè)大學;2000年

本文編號：1343893