發(fā)布時(shí)間：2017-11-25 03:00

  本文關(guān)鍵詞：小鼠IL-35基因畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)

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【摘要】：目的構(gòu)建真核酵母表達(dá)載體pPIC9K與小鼠IL-35基因的重組質(zhì)粒pPIC9K-mIL-35-His,在畢赤酵母GS115菌株中誘導(dǎo)表達(dá),并對其進(jìn)行鑒定。方法以pET-30a-mIL-35為模板,用PCR擴(kuò)增出IL-35去信號肽基因全序列,并在3'端引入His標(biāo)簽,構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-mIL-35-His,經(jīng)SalⅠ線性化重組質(zhì)粒后,用電穿孔方法將該基因轉(zhuǎn)染畢赤酵母細(xì)胞內(nèi)。經(jīng)G418梯度篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子,篩選Mut+表型后經(jīng)PCR進(jìn)一步鑒定IL-35基因與酵母染色體是否整合。小量誘導(dǎo)表達(dá)篩選出高表達(dá)菌株,大量甲醇誘導(dǎo)表達(dá),以SDS-PAGE及免疫印跡(Western blot)鑒定蛋白表達(dá)。結(jié)果小鼠IL-35基因真核酵母表達(dá)載體pPIC9K-mIL-35-His構(gòu)建成功,并且在GS115中通過甲醇誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE及Western blot分析,可見相對分子質(zhì)量約為65 000的目的蛋白。結(jié)論實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的重組質(zhì)粒pPIC9K-mIL-35-His可在畢赤酵母GS115中正確的表達(dá)小鼠IL-35基因。
【作者單位】： 濰坊醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室;濰坊市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科;
【基金】：山東省自然科學(xué)基金(ZR2014HL058) 山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2014WS0462)
【分類號】：R392
【正文快照】： 白介素-35(Interleukin-35,IL-35)是新發(fā)現(xiàn)的抗炎性和抑制性細(xì)胞因子,可以使調(diào)解性T細(xì)胞(簡稱Treg)增殖及抑制效應(yīng)性T細(xì)胞(簡稱Teff)的增殖,并且可能誘導(dǎo)自體調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(簡稱Breg)來治療人類自身免疫性疾病和炎癥性疾病[1]。IL-35可能成為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[2]、過敏性疾病[3-4]，

本文編號：1224504