第 1 章 前言

稻瘟病是水稻的四大重要病害之一，通過田間鑒別可知，它可對水稻各部分造成危害，在其整個生育期均可發(fā)生，主要危害葉片、莖稈、穗部[6,7]（圖 1.1）。田間觀察感染稻瘟病的水稻可見，在苗期，水稻發(fā)病后株體變成黃褐色直至枯死，但不形成明顯病斑，當(dāng)周圍環(huán)境潮濕時，可在葉子表面觀察到青灰色霉菌。依據(jù)氣候條件和品種抗病性不同，稻瘟菌產(chǎn)生的病斑分為四種類型：慢性型病斑、急性型病斑、白點型病斑和褐點型病斑。 稻瘟病菌（Magnaporthe  oryzae）是真菌性病害，其有性世代屬子囊菌亞門真菌，，屬于異宗配合，基部稍膨大，淡褐色，向上色淡，頂端曲狀，上生分生孢子。分生孢子無色，洋梨形或棍棒形、單倍體的絲狀真菌，稻瘟菌的分生孢子梗不分枝，3-5 根叢生，具 2-8 個隔膜，常有 1-3 個隔膜，萌發(fā)時兩端細胞立生芽管，芽管頂端產(chǎn)生附著胞。 

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第 2 章 稻瘟菌 ATP-Lon 蛋白酶（MAP2）功能研究

2.1   實驗材料

QL-901  漩渦混合器、GL-3250  型電熱磁力攪拌器（海門其林貝爾儀器制造有限公司）；PB-10 型 pH 計（Sartorius Group，Germany）；BS 224S  電子分析天平（Sartorius Group，Germany）；超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司）；SPX-2508-Z 型光照生化培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；WP-UP-Ⅱ-20 型超純水儀（四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司）；立式自動壓力蒸氣滅菌器（廈門致微儀器有限公司）；HZQ-F160 雙層振蕩培養(yǎng)搖床（太倉市毫誠實驗儀器制造有限公司）；  MDF-U3386s  超低溫冰箱（Pana Sonic，Japan）；Galanz  微波爐（格蘭仕微波爐電器有限公司）；恒溫混勻儀（Eppendorf，Germany）；D-37520  小型臺式離心機（Thermo，Germany）；PTC 200 PCR 儀（Bio-Rad Laboratories，INC，USA）；UV-2550  型分光光度計（Shimadzu，Kyoto，Japan）；Power PAC 200  電泳儀（Bio-Rad Laboratories，INC，USA）；Champ Gel 5000  數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）；光學(xué)顯微鏡（Nikon 80i，Japan）；DS126271  數(shù)碼照相機（Canon Inc.，Japan）；7500 Real time PCR system（Applied Biosystems，F(xiàn)orest City，CA，USA）；

2.2   研究方法

稻瘟菌 RNA 提取方法根據(jù) Trizol reagent 說明書進行，具體操作步驟如下： 1、實驗器材的準備：在 RNA 提取前，事先準備好滅過菌的 RNase-free  EP管、小研棒、槍頭，0.1%DEPC 水，各步操作在通風(fēng)櫥中進行。 2、收集 CM 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 4 d 的約 0.1 g 菌絲于 1.5 mL RNase-free EP管中，蓋上 EP 管蓋，將 EP 管迅速放入液氮中約 1 min，用鑷子取出 EP 管，迅速打開 EP 管蓋，用事先經(jīng)液氮冷凍過的小研棒充分研磨菌絲至粉末狀。 3、研磨完畢后，立即加入 1 mL Trizol 1 mL，用力震蕩充分混勻，然后室溫靜置 5 min。 4、5 min 后，4 ℃，8500 rpm  離心 5 min。

第 3 章  疏綿狀嗜熱絲孢菌 Mlon 和 Plon  基因的獲得及生物信息學(xué)分析 .......... 53 

3.1   材料與方法... 53
3.2   結(jié)果與分析........... 54
3.3   討論............. 65 
第 4 章  疏綿狀嗜熱絲孢菌中 Mlon 和 Plon  基因的敲除、互補及 Mlon 和 Plon 蛋白的亞細胞定位... 67 
4.1   實驗材料............... 68
4.2   研究方法........................ 71
4.3   結(jié)果與分析...... 83
第5章Mlon和Plon基因在疏綿狀嗜熱絲孢菌生長發(fā)育及逆境自我保護中的功能分析............... 93
5.1   實驗材料................ 93
5.2   研究方法........... 94

第 5 章 Mlon 和 Plon 基因在疏綿狀嗜熱絲孢菌生長發(fā)育及逆境自我保護中的功能分析 

5.1   實驗材料 

前人研究表明，Lon 蛋白的缺失，可導(dǎo)致原核和真核生物產(chǎn)生一些非正常生長的現(xiàn)象，如 M.xanthus 不能形成芽孢，S.Cerevisiae 出現(xiàn)呼吸缺陷性細胞且不能在非發(fā)酵碳源培養(yǎng)基下生長；在哺乳動物及人細胞中，線粒體 lon 活力的喪失可導(dǎo)致細胞的凋亡；M. oryzae 中 lon 基因-MAP1 的缺失使菌株對 H2O2敏感且致病力降低；在 H. polymorpha 中，當(dāng)敲除過氧化物酶體的 HpPln 后，酵母細胞的活力下降；在 A.thaliana 細胞內(nèi)，過氧化物酶體的 lon2 敲除突變株出現(xiàn)過氧化物酶體功能缺陷，進而使生長受阻，而關(guān)于 lon 基因在嗜熱真菌中的功能至今未曾見有報道，因此，在前一章獲得疏綿狀嗜熱絲孢菌 Mlon 和 Plon 基因敲除及互補/亞細胞定位菌株的基礎(chǔ)上，我們以這些菌株為材料進一步研究疏綿狀嗜熱絲孢菌中 Mlon 和 Plon 基因的功能。 

5.2   研究方法

將 9W-WT、△Mlon、△Plon、ΔMlon/Mlon、ΔPlon/Plon 菌株在 PDA 及 CM培養(yǎng)基上分別活化后轉(zhuǎn)接至新的PDA及CM培養(yǎng)基上，然后置于不同溫度（55℃、50  ℃、37  ℃、28  ℃）的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4 天，4 天后，觀察并記錄菌落生長狀況。每個處理每次做 3 個重復(fù)，此實驗做 3 次重復(fù)。1、將 9W-WT、△Mlon、△Plon、Mlon/Mlon、ΔPlon/Plon 菌株在 PDA 及CM 培養(yǎng)基上分別活化后轉(zhuǎn)接至新的 PDA 及 CM 培養(yǎng)基上于 50 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直到有大量分生孢子產(chǎn)生。 2、收集上述菌株的分生孢子，并將各菌株的分生孢子濃度調(diào)至終濃度為1×106個/ml。 3、分別吸取 100 μL 上述各菌株的孢懸液于 150 ml PD 及 CM 液體培養(yǎng)基上，于 50 ℃，150 rpm 搖培 4 天。 4、4 天后，收集各培養(yǎng)瓶中的菌絲體，在吸水紙上吸干后，將其分別平鋪到培養(yǎng)皿上，置于 55 ℃烘干箱中烘干。 5、將烘干后的菌絲于電子天平上稱重。每個菌株每次做 3 個重復(fù)，此實驗做 3 次重復(fù)。
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第 6 章 全文研究結(jié)論

1、以實驗室保存的吉粳 88 稻瘟菌野生型菌株為研究材料，以稻瘟菌中一個與 lon 同源的基因-Map1 為出發(fā)點，通過稻瘟菌基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站在稻瘟菌數(shù)據(jù)庫中進行氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)了另一個依賴 ATP 的 lon 蛋白酶（Magnaporthe grisea_07123），本文將其命名為 MAP2，經(jīng)過構(gòu)建該基因的敲除載體，對該基因進行敲除及進一步研究，發(fā)現(xiàn)敲除菌株比野生型吉粳 88 生長快，但產(chǎn)孢量、附著胞形態(tài)、H2O2敏感性、滲透壓脅迫、細胞壁完整性及致病性方面與野生型菌株無差異。 2、以本實驗室分離獲得的疏綿狀嗜熱絲孢菌 9W 為材料，以稻瘟菌中一個與 lon 同源的基因-Map1 為出發(fā)點，通過與疏綿狀嗜熱絲孢菌基因組進行氨基酸序列比對，在疏綿狀嗜熱絲 孢菌基因組中 獲得了兩個 lon 同源基-Thela2p4_005149 和 Thela2p4_006664，且分別與 Map1 氨基酸序列的相似性為64.61%、24.96%，三者之間的相似性為 50.43%，經(jīng)亞細胞定位預(yù)測分析，hela2p4_005149 和 Thela2p4_006664 分別定位于線粒體和過氧化物酶體，分別將其命名為 Mlon 和 Plon。

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參考文獻（略）

本文編號：133396