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用等位基因特異聚合酶鏈反應檢測 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變

來源：青年人(Qnr.Cn) 更新時間：2010/3/16 19:28:27  【字體： 】

　葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)缺乏癥是中國南方人群中一種常見的遺傳病之一，與藥物性溶血、感染性溶血及新生兒高膽紅素血癥等有密切的關系。引起G6PD缺乏癥的主要原因是G6PD基因點突變［1］�，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)引起中國人G6PD缺乏癥的突變主要是1376G→T、1388G→A、95A→G、392G→T、592C→T及1024C→T等六種突變［2-5］。以往檢測這些已知的突變，主要用錯配擴增酶切法、等位基因寡核苷酸探針雜交等方法［2-5］。最近，杜傳書等［6］報道用突變特異性擴增系統(tǒng)(amplification refractory mutation system,ARMS)來檢測中國人G6PD基因3種常見的突變。在此，我們介紹類似的檢測已知G6PD基因突變的方法。

對象和方法

1　研究對象　經核苷酸順序測定確定為1376G→T的男性樣品3份，經錯配擴增酶切法確定為95A→G的男性樣品3份和392G→T的男性樣品2份。正常對照樣品10份。
2　引物順序及擴增區(qū)域　擴增95A→G的引物：上游引物GdL1：5′-GGCGACGACGACGAAGCGCAG-3′;下游引物GdR2：5′-TTCCTGGCTTTTAAGATTGGG-3′;特異引物95G：5′-CTTCCATCAGTCGGATAGACG-3′。擴增392G→T的引物：上游引物GdL5: 5′-AAGAGAGGGGCTGACATCTG-3′;下游引物GdR5: 5′-CACGCTCATAGAGTGGTGGG-3′;特異引物392T：5′-AGAGGCGGTTGGCCTGTCACA-3′。 擴增1376G→T的引物：上游引物GdL11：5′-TGGTGGCAGGCAGTGGCATCAGCAA-3′;下游引物GdR13：5′-ATGGTCCCGGAGTCCTCCCGACTCG-3′;特異引物1376T：5′-GGGTGAAAATACGCCAGGCCACAA-3′。為了增加等位基因特異性引物的特異性，我們在3種特異引物的3′端的第4個堿基處增加一個錯配堿基。擴增區(qū)域見圖1。在檢測每種突變的聚合酶鏈反應(PCR)中，均含有相應的上、下游引物及等位基因特異性引物。
3　PCR擴增的條件及結果觀察　反應體積為25μl，含基因組DNA 0.5μg，2.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，30～50ng引物，1U Taq DNA聚合酶(PE公司或MBI公司)。擴增95G→A和392G→T的條件為：1×PCR緩沖液(PE公司)，PCR循環(huán)：94℃ 50s，60℃ 50s，72℃ 80s，共31個循環(huán)。擴增1376G→T的條件為：1×PCR緩沖液(MBI公司)，PCR循環(huán)：94℃ 50s，66℃ 50s，72℃ 80s，共31個循環(huán)。將擴增的PCR產物加在20g/L瓊脂糖凝膠上電泳，用溴乙錠染色，在紫外燈下觀察結果。

結果和討論

　　突變特異性擴增系統(tǒng)(ARMS)也稱為等位基因特異性聚合酶鏈反應(allele specific PCR)，是一種檢測已知突變的方法［7］。其原理是根據(jù)PCR擴增時引物的延伸主要取決于引物3′端第1和第2位堿基是否與模板配對，3′端與模板不配對的引物不能延伸，根據(jù)已知的突變可以設計相應的引物。引物設計是此法檢測突變的關鍵。有研究表明，不同的錯配對阻止引物延伸的效果不同，如果在引物3′端的第2～4個堿基處增加一個錯配堿基，則可增加引物延伸的特異性［7,8］；在檢測G6PD基因的某些突變時，A/G錯配更能有效地阻止引物延伸［6］。我們在設計引物時，392T和1376T兩種引物采用A/G錯配，95G引物采用G/T錯配，并在此三種引物3′端的第4個堿基處增加了一個錯配堿基。用等位基因特異PCR檢測已知突變時，還應注意PCR的質控，如果PCR不出現(xiàn)擴增區(qū)帶，原因除了是不存在所檢測的突變外，還可能是DNA的質量問題。因此，用等位基因特異PCR檢測突變時，最好選擇一個PCR擴增片段作為內對照，以便判斷PCR的質量。有些學者選擇與突變位點無關、擴增效果穩(wěn)定的片段作為內對照［6,9］。在我們的檢測中，我們選擇突變位點所在的外顯子及外顯子兩側的區(qū)域的擴增片段作為內對照，使擴增的內對照片段既作為PCR的質控，又可作為擴增突變位點的模板。在PCR產物中，正常樣品只出現(xiàn)一條對照帶，而有突變的樣品，除了出現(xiàn)對照帶外，還出現(xiàn)特異的擴增區(qū)帶。我們曾用此法檢測人β珠蛋白41-42缺失突變，有較好的效果［10］。圖2為檢測三種突變的PCR結果。在檢測95G→A突變的PCR產物中，正常樣品只出現(xiàn)一條812bp的擴增區(qū)帶，有95G→A突變的樣品出現(xiàn)812bp和94bp兩條擴增區(qū)帶；在檢測392G→T突變的PCR產物中，正常樣品只出現(xiàn)一條343bp的擴增區(qū)帶，有392G→T突變的樣品出現(xiàn)343bp和195bp兩條擴增區(qū)帶；在檢測1376G→T突變的PCR產物中，正常樣品只出現(xiàn)一條590bp的擴增區(qū)帶，有1376G→T的樣品出現(xiàn)590bp和261bp兩條擴增區(qū)帶。我們分析了10份正常樣品及含有95G→A、392G→T及1376G→T突變的樣品，未發(fā)現(xiàn)有假陽性和假陰性，表明我們設計的三種等位基因特異性引物具有高度特異性，能特異地檢測上述三種突變。

圖1　3個突變位點的擴增區(qū)域示意圖

1～4號樣品為392G→T的擴增結果:1,2為突變樣品,3,4為正常對照;5～9號樣品為95A→G的擴增結果:5,6為正常對照,7～9為突變樣品;10為分子量標準:100bp ladder;11～15號樣品為1376G→T的擴增結果:11,12為正常對照,13～15為突變樣品;16為分子量標準:1kb ladder
圖2　3個突變位點的PCR擴增結果

　　到目前為止，在中國人中至少已發(fā)現(xiàn)15種G6PD基因突變［1,11］，其中最常見的是1376G→T、1388G→A、95A→G、392G→T、592C→T及1024C→T等六種突變［2-5］，占G6PD基因突變的71%～95%，但仍有部分G6PD缺乏癥的突變類型尚未被發(fā)現(xiàn)。以往檢測這些已知突變主要用錯配擴增酶切法、等位基因寡核苷酸探針雜交等方法。雖然這些方法能有效地篩查G6PD基因突變，但是費用較高、操作煩瑣或需同位素。因此，建立更加簡便、快速、經濟的篩查方法仍有必要。等位基因特異PCR是一種較好的檢測已知突變的方法，已應用于多種遺傳病(如β-地中海貧血)的基因突變的檢測［9,12］。最近，杜傳書等［6］報道了檢測中國人中三種常見G6PD基因突變(1388G→A，1376G→T，95A→G)的等位基因特異PCR方法，對于G6PD缺乏癥的篩查，加快尋找新突變的速度具有重要的意義。與錯配擴增酶切法、等位基因寡核苷酸探針雜交等方法比較，等位基因特異PCR更加簡便、快速、經濟。目前，已建立了檢測中國人中4種常見的G6PD基因突變(1388G→A，1376G→T，392G→T，95A→G)的等位基因特異PCR方法，進一步完善其它常見G6PD基因突變的等位基因特異PCR的篩查方法，對于G6PD基因突變的篩查將具有重要的應用價值。

基金項目:海南省衛(wèi)生廳科研基金資助項目（94－18）
作者單位：蔡望偉（570102　�？�，海南醫(yī)學院生化教研室）
周代鋒（570102　�？�，海南醫(yī)學院生化教研室）
鄺宇（570102　�？�，海南醫(yī)學院生化教研室）
蔡蘭潔（570102　海口，海南醫(yī)學院生化教研室）
周玉英（570102　�？�，海南醫(yī)學院生化教研室）

參 考 文 獻

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(收稿日期:1999-07-05)

    責任編輯：想飛 

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