1  文獻(xiàn)綜述

1.1 我國主要多胎綿羊品種
湖羊來自蒙古羊，主要分布在浙江省和江蘇省的部分縣及上海市郊。公元十世紀(jì)，南宋遷都臨安，黃河流域居民大量南移，將北方綿羊攜帶到江南，安居在江浙交界的太湖流域，故名“湖羊”，亦有“吳羊”、“桑葉羊”等稱謂。湖羊體格相對(duì)較小，頭型狹長，鼻梁隆起，眼大突出，耳大下垂，公、母羊均無角，頸細(xì)長，胸部狹窄，背平直，軀干和四肢細(xì)長，體質(zhì)纖細(xì)，群眾稱之為“繡花腳”，體質(zhì)偏于柔弱，放牧游走能力弱。由于長期舍飼，不見天日，缺乏運(yùn)動(dòng)，世代相傳，形成膽小怕光的習(xí)性[1,2]。 湖羊羔羊平均初生重為 3.3 千克，3 月齡、6 月齡羔羊分別為 21.99、33.76 千克，成年公、母羊分別為 52.0、39.0 千克。公、母羊剪毛量分別為 2.0、1.2 千克。羔羊生后 1～2 天內(nèi)屠宰取羔皮稱為“小湖羊皮”，即湖羊羔皮，皮薄而柔，毛色潔白光亮如絲，花紋奇特，有波浪形美麗圖案，撲而不散，可隨意染色。出口最盛時(shí)，一般湖羊羔皮值 3～4 銀元，而甲級(jí)羔皮價(jià)格最高達(dá) 6 塊銀元，可換 10 擔(dān)大米。公羊在 8 月齡性成熟，而母羊 4～5 月齡初情，6 月齡初配，四季發(fā)情，可 1 年 2 產(chǎn)或 2 年 3 產(chǎn)，每產(chǎn)平均產(chǎn)羔率為 229%。經(jīng)產(chǎn)母羊日產(chǎn)奶量 2.0 千克左右。 湖羊羔皮有“軟寶石”之稱，在國際市場(chǎng)上享有盛譽(yù)，為傳統(tǒng)出口商品。此外，湖羊還具有性成熟早、多胎多產(chǎn)、生長快等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛引入全國各地,尤其是農(nóng)區(qū)各省,是我國農(nóng)區(qū)肉羊業(yè)的支柱品種，與小尾寒羊可謂一時(shí)瑜亮。相對(duì)小尾寒羊，湖羊母性好，奶水多，斷奶羔羊成活率高，耐粗飼，易上膘，抗病力強(qiáng)，容易飼養(yǎng)。 在歷史上,湖羊產(chǎn)區(qū)曾引進(jìn)過小尾寒羊、毛用綿羊品種等用于雜交育種改良。同時(shí)由于湖羊群體中有較大的種質(zhì)差異性，其中部分湖羊的產(chǎn)羔能力并不高。因此，為保護(hù)并提高湖羊種質(zhì)特性，應(yīng)有目的、有組織、有計(jì)劃的開展選育工作。目前有越來越多的國內(nèi)外研究學(xué)者開始了對(duì)湖羊高繁殖力候選基因分子標(biāo)記的相關(guān)性研究。石國慶等[3]通過應(yīng)用酶免疫測(cè)定法和放射免疫測(cè)定法對(duì)湖羊和新疆細(xì)毛羊妊娠早期血清中一些主要激素的激素水平進(jìn)行檢測(cè)，從而對(duì)多胎、單胎綿羊妊娠早期的生殖內(nèi)分泌差異進(jìn)行比較。試驗(yàn)結(jié)果為研究其多胎作用機(jī)制提供了重要參考。此外，相關(guān)的分子遺傳研究也已取得顯著進(jìn)展，已確定了湖羊繁殖力主效基因。 
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1.2 綿羊繁殖力及其候選基因

繁殖力是指單位個(gè)體產(chǎn)出有生命后代的能力，同時(shí)也指代一個(gè)群體的后代出生率。在綿羊這一種群中，繁殖力指的是母羊產(chǎn)羔數(shù)（Litter Size,LS）的多少，主要受遺傳因素和環(huán)境因素（日糧營養(yǎng)，季節(jié)氣候，畜群類別和飼養(yǎng)管理系統(tǒng)等）影響。產(chǎn)羔數(shù)是一個(gè)復(fù)雜的低遺傳力（小于 0.1）繁殖性狀[4]，亦是綿羊育種計(jì)劃中極為重要的繁殖性狀[5]。近年來，很多育種學(xué)家均在分子領(lǐng)域開展著大量的相關(guān)性研究，相繼發(fā)現(xiàn)了一些能夠影響綿羊繁殖力的候選基因（表 1.1）。  BMPR-1B 基因位于綿羊的 6 號(hào)染色體上，參與 BMP-2（Bone morphogeneticprotein-2)、BMP-4、BMP-6/Vgr-1（Vg-related protein-1）、BMP-7／OP-1（Osteogenic protein-1）、GDF-5（Growth differentiation factor-5)以及 BMP15 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中有表達(dá)[33]。BMPR-IB 敲除的小鼠呈現(xiàn)卵丘擴(kuò)展和受精缺陷、不育等特征[34]。 20 世紀(jì) 80 年代，在對(duì)澳大利亞綿羊的產(chǎn)羔數(shù)和排卵率分別進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)了 Booroola（FecB）基因突變[35]。研究表明，F(xiàn)ecB 基因位于 BMPR-IB 基因上，是 BMPR-IB 基因編碼區(qū)第 746 位發(fā)生 A-G 的改變，引起第 249 位氨基酸由谷氨酰胺變?yōu)榫彼?Q249R)[36]。Q249R突變體可能減弱了 BMPR-IB 與其配體的識(shí)別[37]。FecB 突變純合體的血漿 FSH(Follicle stimulating  hormone)和 LH(Luteinizing  hormone)濃度比突變雜合體的高，雜合體比野生純合體高，而突變體顆粒細(xì)胞 FSH 受體和 LH 受體表達(dá)水平高，導(dǎo)致更多的小卵泡發(fā)育[38,39]。 

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2  引言 

動(dòng)物生產(chǎn)性能是一種綜合性能的體現(xiàn)。通過對(duì)動(dòng)物生化特性的研究，進(jìn)而對(duì)與動(dòng)物生產(chǎn)性能的關(guān)系進(jìn)行分析，不僅有利于增加選擇的作用強(qiáng)度，而且對(duì)于提高選育的準(zhǔn)確性和時(shí)效性也具有極其重要的作用。而篩選影響綿羊產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的候選基因，并闡明其作用機(jī)制，不僅有助于了解綿羊的繁殖調(diào)控機(jī)理，同時(shí)對(duì)畜群的遺傳改良和進(jìn)一步進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇具有重要意義。 產(chǎn)羔數(shù)是綿羊繁殖性能的主要體現(xiàn)，亦是綿羊的重要經(jīng)濟(jì)性狀，是制約綿羊養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的重要因素，提高母畜繁殖性能是綿羊業(yè)多產(chǎn)高產(chǎn)的重要基礎(chǔ)，，與綿羊養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益緊密相連。因此，如何提高綿羊產(chǎn)羔數(shù)無疑是全國養(yǎng)羊業(yè)獲得持續(xù)經(jīng)濟(jì)效益的核心問題。綿羊產(chǎn)羔數(shù)性狀屬低遺傳力（0.1）閾性狀[165]，因此從分子水平上對(duì)產(chǎn)羔數(shù)及其生長性狀相關(guān)的候選基因或與 QTL 緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行選擇，被認(rèn)為是目前最為有效的遺傳改良途徑。布魯拉(Booroola )美利奴綿羊的平均產(chǎn)羔率高達(dá) 350%[166]。而我國所特有的多胎綿羊品種：湖羊和小尾寒羊皆具備高產(chǎn)多胎等優(yōu)良繁殖特性，為我國綿羊群體中極富價(jià)值的基因庫。 目前綿羊的育種工作已進(jìn)入到利用綿羊基因組和功能基因組信息開展分子標(biāo)記輔助育種的新階段，通過國內(nèi)外大量學(xué)者對(duì)影響綿羊產(chǎn)羔數(shù)基因的深入研究，已發(fā)現(xiàn)大量影響綿羊繁殖力的候選基因，但其大多進(jìn)行的是單分子標(biāo)記研究[167]，而對(duì)影響綿羊產(chǎn)羔性狀的多個(gè)基因聯(lián)合效應(yīng)相關(guān)深入研究鮮有報(bào)道。如何拓展基因聚合的分子標(biāo)記數(shù)量，基于基因聚合的策略開辟綿羊繁殖性狀遺傳改良的新途徑已然成為當(dāng)前綿羊育種的主要目標(biāo)。但就研究前景來看，利用多基因聚合原理對(duì)綿羊產(chǎn)羔性狀進(jìn)行綜合選擇，從而加快育種進(jìn)展，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)性狀整體改良，是分子育種的必然趨勢(shì)�；蚓酆霞夹g(shù)目前多應(yīng)用于植物研究中[168,169]，并已成功在生產(chǎn)實(shí)踐中開展應(yīng)用[170]。因此，本試驗(yàn)力求從影響繁殖性能的候選基因中篩選部分基因，通過分析多基因互作效應(yīng)來尋找控制產(chǎn)羔性能的分子標(biāo)記，從而應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中，切實(shí)推進(jìn)綿羊養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展。 
本研究以中原地區(qū)肉羊生產(chǎn)主體品種湖羊和小尾寒羊?yàn)橹饕芯繉?duì)象，以杜泊羊?yàn)閰⒄杖后w，首次對(duì) B4GALNT2、ZAR1 基因群體遺傳特性進(jìn)行分析；其次，根據(jù)已有的研究成果，從眾多候選基因中篩選出重要的 SNP 位點(diǎn)，首次對(duì)影響綿羊產(chǎn)羔數(shù)的 17 個(gè)主要候選基因中的 20 個(gè)重要 SNP 與對(duì)產(chǎn)羔數(shù)的單獨(dú)效應(yīng)及互作效應(yīng)進(jìn)行分析；在證實(shí)單基因型效應(yīng)的基礎(chǔ)上，突破單分子標(biāo)記的局限性，著重對(duì)多基因突變體互作效應(yīng)進(jìn)行分析�；诨蚧プ鞯南嚓P(guān)理論首次對(duì)三個(gè)綿羊品種多個(gè)重要 SNP 在不同組合方式下的遺傳效應(yīng)進(jìn)行評(píng)估，以期找出新的分子標(biāo)記；最后，對(duì)各主效基因 SNP 對(duì)母羊體重、體尺指標(biāo)間關(guān)聯(lián)性性進(jìn)行分析。上述研究的目的旨在完善綿羊多胎性分子遺傳基礎(chǔ)研究內(nèi)容，進(jìn)一步揭示綿羊多胎性分子遺傳機(jī)制，為育種實(shí)踐中科學(xué)選種和有益基因聚合提供理論依據(jù)。 
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3  試驗(yàn)一  綿羊 B4GALNT2 和 Zar1 基因遺傳變異分析 .... 21
3.1 試驗(yàn)材料 ..... 21
3.2 試驗(yàn)方法 ..... 23 
3.3  結(jié)果與分析 ........ 29
3.4  討論與小結(jié) ........ 33 
4   試驗(yàn)二  17 個(gè)候選基因中重要 SNP 對(duì)綿羊產(chǎn)羔數(shù)單基因效應(yīng)分析 ........... 36 
4.1 試驗(yàn)材料 ..... 36 
4.2 試驗(yàn)內(nèi)容和方法 ......... 36 
4.3 結(jié)果與分析 ......... 40
4.4 討論與小結(jié) ......... 46 
5  試驗(yàn)三  17 個(gè)候選基因中重要 SNP 對(duì)綿羊產(chǎn)羔數(shù)的互作效應(yīng)分析 ..... 49 
5.1 材料與方法 ......... 49 
5.2 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 ..... 50 
5.2.1 多基因互作效應(yīng)分析模型 ..... 50 
5.2.2 數(shù)據(jù)分析步驟 .......... 50 
5.3 結(jié)果與分析 ......... 50 
5.4 討論與小結(jié) ......... 53 

6  試驗(yàn)四  17 個(gè)候選基因中重要 SNP 與母羊體重性狀關(guān)聯(lián)分析 

尋找分子標(biāo)記對(duì)動(dòng)物繁殖性狀進(jìn)行遺傳改良無疑是一種極為有效的改良方式，尤其是針對(duì)綿羊產(chǎn)羔數(shù)這類低遺傳力（0.1）閾性狀。而在實(shí)際生產(chǎn)過程中，單靠分子標(biāo)記對(duì)綿羊進(jìn)行選擇顯然是不夠的，同時(shí)鑒于其較高的檢測(cè)成本，在綿羊大規(guī)模養(yǎng)殖的過程中，其可實(shí)施性略顯不強(qiáng)。因此針對(duì)高產(chǎn)綿羊的體型外貌，建立一種高效、便捷的選擇方式顯得尤為重要。 在實(shí)際生產(chǎn)過程中，觀察發(fā)現(xiàn)，繁殖力高的母羊，其體重明顯偏低，推測(cè)對(duì)產(chǎn)羔數(shù)有顯著影響的分子標(biāo)記，是否與母羊體重之間也緊密相關(guān)。迄今為止，該領(lǐng)域?qū)W者的相關(guān)研究大都專注于尋找能夠顯著提高綿羊產(chǎn)羔數(shù)的主效基因，亦或是主效基因各基因型與 90 日齡羔羊體尺性狀的關(guān)聯(lián)分析等[201]。而忽略了相關(guān)分子標(biāo)記與母羊體重之間的關(guān)聯(lián)性，鑒于此，本試驗(yàn)首次對(duì)影響綿羊產(chǎn)羔數(shù)的 17 個(gè)候選基因的 20 個(gè)重要 SNP 位點(diǎn)與母羊體重進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。
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結(jié)論 

（1）本研究首次對(duì)湖羊、小尾寒羊和杜泊羊 B4GALNT2 全基因進(jìn)行掃描分析，未發(fā)現(xiàn)任何變異位點(diǎn)；在綿羊 Zar1 基因上首次發(fā)現(xiàn)兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)對(duì)三個(gè)綿羊品種各生產(chǎn)性狀影響均不顯著。表明綿羊 B4GALNT2、Zar1 基因在進(jìn)化中相對(duì)比較保守。 
（2）；利利用飛行時(shí)間質(zhì)譜生物芯片系統(tǒng)（Sequenom MassArray），對(duì)影響綿羊產(chǎn)羔數(shù)的17 個(gè)主要候選基因（FecB、GDF9、MTNR1A、ESR、RBP4、PRL、PRLR、FecXL、INHA、INHBA、BMP4、FSH-β、IGF-Ι、IGF-II、PGR、RXRG、Zar1）中的 20 個(gè)重要 SNP 與對(duì)產(chǎn)羔數(shù)的單獨(dú)效應(yīng)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)： ①多個(gè)位點(diǎn)單基因效應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)除證實(shí)了多胎主效基因 FecB 與小尾寒羊經(jīng)產(chǎn)產(chǎn)羔數(shù)密切關(guān)聯(lián)；②之外，MTNR1A（G604AMTNR1A 基因的 G605A 位點(diǎn)在小尾寒羊群體中僅存在 GG、AG 兩種基因型，首次觀察到 MTNR1A（G605A）突變位點(diǎn)對(duì)小尾寒羊經(jīng)產(chǎn)產(chǎn)羔數(shù)有顯著影響；③首次發(fā)現(xiàn)湖羊）和 GDF9 基因 G477A 位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型為 GA 型，優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)锳，有利基因型 AA 型對(duì)湖羊產(chǎn)羔數(shù)影響顯著。 帶格式的: 兩端對(duì)齊, 縮進(jìn): 首行縮進(jìn):  0 字符, 定義網(wǎng)格后不調(diào)整右縮進(jìn), 行距: 固定值 20 磅, 不對(duì)齊到網(wǎng)格    以上各分子標(biāo)記可作為綿羊產(chǎn)羔數(shù)選擇的可用分子標(biāo)記。 
（3）對(duì) 17 個(gè)候選基因 20 個(gè)重要 SNP 與產(chǎn)羔數(shù)互作效應(yīng)分析，發(fā)現(xiàn)有顯著聚合效應(yīng)的 7 個(gè)位點(diǎn)：FecB(A746G)、GDF9(G477A)、ESR(C363G)、PGR(C70T)、MTNR1A(G605A)、TGF-1(G4988A)和 PRLR(G304A)。
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參考文獻(xiàn)(略)

本文編號(hào)：63139