第一章 文獻綜述

由于植物細胞具有全能性，理論上來說，在一定環(huán)境條件下，植物任何組織部位的體細胞都可以誘導(dǎo)成為胚性細胞。但在體細胞胚胎誘導(dǎo)過程中，以不同物種或同一物種的不同器官為外植體，誘導(dǎo)體細胞胚胎的結(jié)果是大不相同的。胡蘿卜的胚、下胚軸、幼根、主根、葉柄、花序軸組織以及原生質(zhì)體等均可誘導(dǎo)形成體細胞胚胎；但荔枝僅以幼胚和莖尖為外植體，才能誘導(dǎo)形成體細胞胚胎[39]；棉花可誘導(dǎo)體細胞胚胎的外植體以下胚軸為最佳，其次為子葉[40]；盡管人們以玉米的幼胚、成熟胚、花藥、幼苗切段、幼苗葉基部、幼苗基部葉片、幼胚的芽頂分生組織、雌雄幼穗、雄幼穗穎片、未成熟花序、幼苗芽頂分生組織及中胚軸、節(jié)間芽組織、莖節(jié)切段等為外植體進行了愈傷組織的誘導(dǎo)及植株再生的分化[41,42,43,44,45,46,47]，結(jié)果表明玉米以授粉后 12-15 天的幼胚為外植體，獲得體細胞胚胎的可能性最大。因為不同物種和不同組織器官對外界刺激的反應(yīng)能力存在差異，所以不同外植體誘導(dǎo)體細胞胚胎發(fā)生的難易程度也存在差異。

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第二章 玉米體細胞胚胎發(fā)生和形態(tài)建成的組織學(xué)研究

2.1 實驗材料

以玉米骨干自交系 Y423 為材料。對其進行體細胞胚胎誘導(dǎo)，組織學(xué)研究的材料為組織培養(yǎng)過程獲得的非胚性愈傷組織、胚性愈傷組織和體細胞胚胎等。為了確保材料能全面覆蓋再生過程中主要類型的愈傷組織，組織培養(yǎng)材料各培養(yǎng) 3 批，批次間隔為一個月。

2.2 實驗方法

對授粉后 12-15d 的玉米幼胚（大小為 1.5-2.5mm）進行取材，田間取整穗，在實驗室無菌條件下剝除苞葉，玉米籽粒于 75%酒精表面消毒 3 次，待酒精揮發(fā)后，使用無菌刀挑取幼胚，胚盾片向上接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，平均每皿 30 粒左右，于 24℃暗培養(yǎng)。培養(yǎng) 20-25d，剔除小芽，將誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)移至繼代培養(yǎng)基中，于24℃散光培養(yǎng)，每20d繼代一次，繼代3-4次后，胚性愈傷組織大量出現(xiàn)。再進一步繼代，獲得體細胞胚胎（本實驗室專利，玉米體細胞胚胎的誘導(dǎo)方法，ZL 2011 1 0024436.0）。將體細胞胚胎轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基中，于24℃，光培養(yǎng) 12h，光照強度為 7500lux，暗培養(yǎng) 8h。5-7d 左右，體細胞胚胎會出現(xiàn)綠芽點，20-30d左右，同時長根長芽，40d左右成苗。實驗所需培養(yǎng)基如表2-1。

第三章 玉米體細胞胚胎發(fā)生相關(guān)基因表達分析.........27

3.1 實驗材料 ........................27

3.2 實驗方法 ...................27 

3.3 結(jié)果與分析 .........39 

3.4 討論 ...............53

3.5 結(jié)論 ..............55

第四章 體細胞胚胎相關(guān)基因的克隆及分析.........57

4.1 實驗材料 .................57

4.2 實驗方法 ..............57 

4.3 結(jié)果與分析 ............59 

4.4 討論 .......68

4.5 結(jié)論 ...................69

第五章 玉米體細胞胚胎蛋白質(zhì)組分析 ...71

5.1 實驗材料 .........71

5.2 實驗方法 ............71 5.3 結(jié)果與分析 .................75 

5.4 討論 ....................94

5.5 結(jié)論 ........96

第五章 玉米體細胞胚胎蛋白質(zhì)組分析

5.1 實驗材料

玉米骨干自交系 Y423 的胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織。

5.2 實驗方法

（1）蛋白提取液（10%TCA/丙酮溶液）：TCA 晶體 5g；丙酮溶液 50ml 充分混勻，用時加入 β-巰基乙醇 35μl。（2）PMSF（苯甲基磺酰氟）溶液（100mM）：加 PMSF 17.42mg 溶于 1ml異丙醇。（3）蛋白裂解液：尿素 10g；硫脲 3.8g；4% CHAPS (w/v) 1g；ddH2O 定容到 25ml，用時加入 100 mM PMSF 10 μl。（4）蛋白溶解液：加 SDS10mg；TEAB buffer 5ml；ddH2O 5ml；混勻。（1）稱取約為 1g 樣品，于不斷加有液氮的冷研缽中研磨至粉末狀,同時加0.1g PVPP（cross-linking polyvinylpyrrolidone，交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮）；（2）將研磨后的樣品等量分裝于預(yù)冷的 1.5ml 離心管中，加入 3-4 倍體積的蛋白提取液，混勻后于-20 C 沉淀 2h；（3）4 C，35000 g 離心 30 min，棄上清，向沉淀中加入 3-4 倍體積的含有0.07%（v/v）β-巰基乙醇的冷丙酮，混勻后于-20 C 沉淀 1h；（4）重復(fù)步驟 3，直至沉淀為白色；（5）4 C，35000 g 離心 30 min，棄上清，通過真空離心干燥獲得蛋白粉末；（6）稱取 20mg 蛋白粉，加入 80μl 蛋白裂解液，混勻后再分別加入 10 μl100 mM PMSF，和終濃度為 2mM 的 EDTA，冰山超聲 5min 助溶后，添加終濃度10mM的DTT，繼續(xù)超聲15min，超聲條件：功率200W，超聲2s，間歇3s；（7）4 C 25000 g 離心 20 min，取上清；（8）上清液在 56 C 條件下加入終濃度 10 mM DTT 處理 1 小時，還原打開二硫鍵；（9）立刻加入終濃度 55 mM IAM 暗室靜置 45min，進行半胱氨酸的烷基化封閉；（10）加入 4-5 倍體積于樣品溶液的預(yù)冷丙酮，，-20 C 沉淀 2 h；（11）4 C 25000 g 離心 20 min，棄上清；（12）加入200μl 蛋白溶解液，超聲溶解15min，4 C 25000 g離心20 min，取上清用于定量。
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第六章

（1）對玉米骨干自交系 Y423 誘導(dǎo)獲得的體細胞胚胎進行石蠟切片和掃描電鏡觀察，從組織學(xué)上確定了玉米體細胞胚胎發(fā)生的 5 個階段：原胚、球形胚、梨形胚、盾片胚、成熟胚，模擬合子胚的發(fā)育過程。（2）采用 cDNA-AFLP 技術(shù)，從轉(zhuǎn)錄組水平對玉米胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織進行研究，共獲得條帶數(shù)為6583個，差異表達片段為2297個，以非胚性愈傷組織為對照，在胚性愈傷組織中呈上調(diào)表達的條帶為 1023 個，而呈下調(diào)表達的條帶數(shù)為 1274 個。經(jīng)回收、測序、比對，最后獲得 117 個可能促進體細胞胚胎發(fā)生的基因片段。（3）成功克隆獲得了 2 個與體細胞胚胎發(fā)生相關(guān)的未知基因，分別命名ZmSUF4 和 ZmDRP3A，CDS 序列大小分別為 1080bp 和 2466bp。這兩個基因都與高粱、谷子和水稻同源性較近。（4）采用 iTRAQ 技術(shù)，從蛋白質(zhì)組水平對玉米胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織進行研究，共鑒定到蛋白數(shù)為 5592 個，差異表達蛋白數(shù)為 632 個，以非胚性愈傷組織為對照，在胚性愈傷組織中上調(diào)表達的蛋白數(shù)為 366 個，下調(diào)表達的蛋白數(shù)為 266 個。

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參考文獻（略）

本文編號：57031