1 文獻(xiàn)綜述   

1.1 類(lèi)黃酮的基本概況 
類(lèi)黃酮類(lèi)物質(zhì)作為一種次生代謝物廣泛存在于高等植物中，包括查耳酮、黃酮、異黃酮、花色素苷、黃烷酮、原花色素等六大類(lèi)。相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究表明，類(lèi)黃酮以保護(hù)性物質(zhì)的身份存在于植物中，起著重要的生理作用，例如抵御病原菌侵害植物、在豆科植物形成根瘤菌的過(guò)程中協(xié)調(diào)植物與微生物的關(guān)系、減少紫外線對(duì)植物的傷害等等。類(lèi)黃酮類(lèi)物質(zhì)在應(yīng)用方面也具有重要功能，例如對(duì)動(dòng)物血管具有軟化功能、抑制癌癥發(fā)生、機(jī)體內(nèi)自由基的清除等生理功能，這些功能具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，已經(jīng)是植物次生代謝物應(yīng)用研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)。多酚類(lèi)化合物類(lèi)黃酮，是普遍分布在各種不同植物體內(nèi)的一大類(lèi)低分子量次生代謝產(chǎn)物 ，它的基本結(jié)構(gòu)式是 C6 - C3 - C6,通常被稱(chēng)作“黃烷核”，是一類(lèi)三元環(huán)化合物[1]，由兩個(gè)芳香環(huán)和一個(gè)雜環(huán)組成，母核結(jié)構(gòu)由芳香環(huán) A 和芳香環(huán) B 通過(guò)中間 C 環(huán)相互連接而成 15 碳化合物[2]（如圖 1.1）。在植物代謝中類(lèi)黃酮化合物發(fā)揮著十分重要的生理作用。大自然中，植物體內(nèi)的類(lèi)黃酮類(lèi)物質(zhì)發(fā)揮及其重要的作用，許多的功能都與該物質(zhì)的積累密切相關(guān)，類(lèi)黃酮類(lèi)物質(zhì)與花、果實(shí)以及種子顏色的形成有關(guān)，其為主要的顯色物質(zhì)，促進(jìn)色素形成，用來(lái)吸引傳播花粉和種子的動(dòng)物及昆蟲(chóng)； 參與豆科植物體的根瘤菌形成過(guò)程，能夠有效提高農(nóng)作物總產(chǎn)量[4]，帶來(lái)更多的經(jīng)濟(jì)效益；調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)素的運(yùn)輸，類(lèi)黃酮化合物可以抑制生長(zhǎng)素的轉(zhuǎn)運(yùn)[5]，通過(guò)與生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸抑制劑 NPA 競(jìng)爭(zhēng)的方式；能夠有效保護(hù)植物抵御紫外線傷害[6]。植物脅迫發(fā)生時(shí),類(lèi)黃酮化合物積累在植物器官中，它可以有效吸收UV 輻射光,從而減少對(duì)植物體內(nèi)大分子（核酸、蛋白質(zhì)等）的破壞作用,保護(hù)生物體的正常功能。例如栽培變種玉米與野生型玉米同時(shí)經(jīng) UV-B 輻射后，野生型玉米的 DNA損傷程度遠(yuǎn)大于栽培變種[7]。一項(xiàng)研究表明，擬南芥突變體植株與正常植株相比較，類(lèi)黃酮化合物含量較高，能夠抵抗大劑量的 UV 輻射脅迫[8]。同時(shí)，類(lèi)黃酮是一類(lèi)生物活性很強(qiáng)的化合物，是一種天然的抗氧化劑，能夠有效清除體內(nèi)的自由基(Free Reaical)及毒素，預(yù)防、減少疾病的發(fā)生[9]；不但具有減少心肌耗氧量功能，同時(shí)可以增加心肌供氧量，起到預(yù)防心腦血管疾病的功效；防治骨質(zhì)疏松癥；減輕更年期綜合癥[10]。 
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1.2  查耳酮合酶的研究概況及進(jìn)展
查耳酮合酶（chalcone  synthaseCHS）是植物類(lèi)黃酮代謝途徑的入口酶，也是此途徑的第一個(gè)關(guān)鍵限制酶。查耳酮合酶以來(lái)源于苯丙氨酸代謝途徑的丙二酰輔酶 A (malonyl CoA)和香豆酰CoA(coumaryl CoA)為底物，催化其生成柚皮素查耳酮(narigenin chalcone)。值得注意的是在逆境條件下，查耳酮合酶的生理底物可以是咖啡酰輔酶 A（caffeoyl CoA）或肉桂酰輔酶 A(cinnamoyl CoA)[25]。植物中含有查耳酮合成酶, 其在很多生理生化活動(dòng)中具有重要生理功能,近年來(lái)已經(jīng)備受關(guān)注，成為植物生理生化和分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。研究表明，CHS 的功能主要表現(xiàn)在色素合成、防止紫外線傷害、能夠有效抵御病原真菌侵染、參與豆科植物根瘤菌形成過(guò)程、促進(jìn)花粉管生長(zhǎng)、吸引昆蟲(chóng)和動(dòng)物、調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素運(yùn)輸?shù)确矫鎇26]。在應(yīng)用方面，類(lèi)黃酮類(lèi)物質(zhì)具有軟化血管、清除體內(nèi)自由基、抗癌、防止骨質(zhì)疏松等生理作用，已經(jīng)成為植物次生代謝物應(yīng)用研究的焦點(diǎn)[27]。  自 1983 年第一次從歐芹（Parsley）里克隆取得 CHS 以來(lái),研究人員不斷實(shí)驗(yàn),隨著研究不斷拓寬，現(xiàn)在已經(jīng)能夠從苔蘚類(lèi)植物、裸子植物等多個(gè)物種中克隆了 CHS 基因的 cDNA  序 列  ,  涉 及 的 植 物 包 括 小 立 碗 蘚 (Physcomitrella  patens)、 擬 南 芥(Arabidopsis)、地錢(qián) (Marchantiapolymorpha)、 赤松(Pinus  densiflora)、大豆(Glycine max)、豌豆(Pisum satium)、矮牽牛(Petunia hybrida)、小麥(Triticum aestivum )、水稻(Orzysativa)、高粱(Sorghum bicolor)、玉米(Zea mays)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、翅葉決明(Cassia alata )、啤酒花(Humulus lupulus)、金魚(yú)草（Zntirrhinum）、山茶(Camellia sinensis)、非洲菊(Gerbera  hybrid)、掌葉大黃(Rheum  palmatum)、虎杖(Polygonum cuspidatum)、蝴蝶蘭（Phalaenopsis hybrida）、甜蕎（Fagopyrum esculentum）、牡丹(Paeonia suffruticosa)、水母雪蓮(Saussurea medusa)等[28]。 
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2 葡萄 CHS 基因的克隆以及生物信息學(xué)分析 

2.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器 
2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與耗材 
（1）葡萄品種：為種植的栽培種歐洲葡萄（Vitis vinifera）； 克隆載體：為 pEASY—T 1Simple Cloning Vector 購(gòu)置于寶生物工程（大連）有限公司； 實(shí)驗(yàn)中所用 PCR 引物:購(gòu)自生工生物公司； 實(shí)驗(yàn)中所用的酶:購(gòu)自生工生物公司； DEPC(焦炭酸二乙酯)：購(gòu)自生工生物公司； 瓊脂糖：購(gòu)自上海 Invitrogen 公司； 反轉(zhuǎn)錄試劑盒：購(gòu)自上海 Invitrogen 公司； 膠回收試劑盒：購(gòu)自北京 TIANDZ 公司； E.coli DH5α：為本實(shí)驗(yàn)室原始保存原菌。 
（2）所需耗材：將 1.5ml  Eppendorf  tube 浸泡在盛有 1‰DEPC 水的桶中，將其置于儲(chǔ)藏柜中進(jìn)行過(guò)夜處理，次日取出，用報(bào)紙包好，在滅菌鍋中高溫高壓滅菌 40min，80℃烘干 3 后取出備用。研缽、研杵、鑷子、藥匙、藥瓶、移液管等洗凈，將物品外面包被一層錫鉑紙，將烘箱溫度調(diào)至 180℃，，烘烤 3-5 小時(shí)。      
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2.2 實(shí)驗(yàn)方法
在 TIGR 基因索引數(shù)據(jù)庫(kù)里，以 Grape 和 chalcone synthase 兩個(gè)關(guān)鍵詞語(yǔ)進(jìn)行搜索，搜索到具有同源性 VvCHS 基因所有 EST 序列。根據(jù)已報(bào)道的蝴蝶蘭、苦蕎、藍(lán)莓等其他物種中查耳酮合酶基因序列長(zhǎng)度在 1140bp—1200bp 之間為參考，選擇長(zhǎng)度合適的序列。對(duì)得到的序列利用 NCBI 的 ORF  Finder程序進(jìn)行 ORF 預(yù)測(cè)，去除大部分重復(fù)的 CHS 基因，再篩選掉開(kāi)放閱讀框不符合的 EST 序列，經(jīng)分析比對(duì)，拿到五個(gè)具有符合條件的基因序列。利用 NCBI 中的 CD  Search程序預(yù)測(cè)序列是否具有 CHS 保守結(jié)構(gòu)域，在葡萄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中，將 5 個(gè)序列進(jìn)行定位，確定其確實(shí)為葡萄中序列，并對(duì)其中 VvCHS1 和 VvCHS3 進(jìn)行基因克隆。
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3 葡萄 CHS 基因在不同處理?xiàng)l件下的誘導(dǎo)表達(dá) ......... 46 
3.1  材料處理 ........... 46 
3.2 RNA 的提取、純化及 cDNA 的合成 ...... 46 
3.3  引物設(shè)計(jì) ........... 46 
3.4  實(shí)時(shí)熒光定量 PCR .......... 46 
3.5  結(jié)果 ........... 47 
3.5.1  葡萄 RNA 電泳檢測(cè) ..... 47 
3.5.2  實(shí)時(shí)熒光定量 PCR ....... 48 
3.6  討論 ........... 49 
4 結(jié)論 ....... 50 

3 葡萄 CHS 基因在不同處理?xiàng)l件下的誘導(dǎo)表達(dá) 

3.1 材料處理 
（1）紫外線處理
將紫外燈置于葉片上方 20cm 處，強(qiáng)度為 2w/m2 ，相應(yīng)劑量為 1.2KJ/m2。照射時(shí)間：10 分鐘，避光。將植株遮光，處理的葉片用錫箔紙包好。紫外處理后：0h、2h、4h、8h、12h、24h 和 48h 時(shí)剪取葉片，依次編號(hào)，迅速凍于液氮中，保存于-80℃冰箱待用。 

（2）水楊酸處理
常溫下，用 10-5M SA 溶液涂抹葡萄葉片，在噴施后 0h、2h、4h、8h、12h、24h 和48h 時(shí)剪取葉片，依次編號(hào)，迅速凍于液氮中，保存于-80℃冰箱待用。

葡萄葉片經(jīng)過(guò)紫外線輻射和水楊酸噴灑后，VvCHS1 和 VvCHS3 基因相對(duì)表達(dá)量發(fā)生了不同程度變化，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 結(jié)果顯示：兩者在不同處理?xiàng)l件下均在 12h 以前呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在 12h 時(shí)表達(dá)量最大，隨后緩慢下降（圖 3.2）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：VvCHS 基因的表達(dá)受外界環(huán)境因素影響，紫外線輻射和水楊酸噴灑脅迫處理?xiàng)l件下，導(dǎo)致 CHS 基因的表達(dá)相關(guān)元件得到響應(yīng)，并啟動(dòng)表達(dá)機(jī)制，且受刺激部位優(yōu)先積累查耳酮。本實(shí)驗(yàn)對(duì)葡萄葉片進(jìn)行 UV 處理，結(jié)果顯示,CHS 基因表達(dá)量增加。水楊酸是生物體內(nèi)的信號(hào)傳遞分子，在植物防御病毒、提高其非生物抗逆性等方面起重要作用,被認(rèn)為是啟動(dòng)植物體防御機(jī)制的信號(hào)分子，本實(shí)驗(yàn)對(duì)葡萄葉片進(jìn)行 SA 處理，結(jié)果顯示,CHS 基因表達(dá)量增加。 

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結(jié)論 

根據(jù)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，得出了以下結(jié)論：
1.本實(shí)驗(yàn)采用 RT-PCR 技術(shù)，從葡萄中成功克隆得到兩個(gè) CHS 基因的 cDNA 開(kāi)放閱讀框（ORF）序列 VvCHS1、VvCHS3。其中，VvCHS1 序列長(zhǎng) 1182bp，編碼 393 個(gè)氨基酸；VvCHS3 序列長(zhǎng) 1170bp，編碼 389 個(gè)氨基酸。
2.從 TIGR 基因索引數(shù)據(jù)庫(kù)和葡萄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中經(jīng)檢索后分析，最后確定了 5 個(gè)具有完整 ORF 區(qū)和保守結(jié)構(gòu)域的葡萄 CHS 基因。利用軟件對(duì) 5 個(gè) VvCHS 基因進(jìn)行了基礎(chǔ)生物學(xué)預(yù)測(cè)分析。包括保守結(jié)構(gòu)域、編碼氨基酸組成、一級(jí)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、高級(jí)結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子所含的順式作用元件和系統(tǒng)發(fā)生等方面。系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果表明兩個(gè) VvCHS 基因編碼的氨基酸雖然屬于同一大組，但分屬于第一大組的不同亞組，這表明基因在進(jìn)化中產(chǎn)生了歧化，形成了植物 CHS 的多樣性。      
3.采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)，對(duì) VvCHS1 和 VvCHS3 在不同處理?xiàng)l件（如 UV 和SA）下的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了分析。VvCHS1 和 VvCHS3 在受到 UV 和 SA 不同時(shí)間處理?xiàng)l件下，其相對(duì)表達(dá)量都發(fā)生了不同程度的變化，呈先上升后緩慢下降趨勢(shì)，且表達(dá)量最高出現(xiàn)在 12h 處。葡萄葉片在被 UV 輻射和噴灑 SA 后，VvCHS1 和 VvCHS3 表達(dá)量的變化趨勢(shì)大體一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明 VvCHS1 和 VvCHS3 參與植物逆境脅迫響應(yīng)途徑。 
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參考文獻(xiàn)(略)

本文編號(hào)：54924