1引言

近年來，很多企事業(yè)單位從歐美及日本等國家大量引進彩色葉植物新品種，其中有的品種表現(xiàn)優(yōu)良；很多品種適應性較差，對我國園林建設具有潛在不良影響。其實，我國彩葉樹種資源十分豐富，很多彩葉樹種資源尚未深入研究與開發(fā)應用，元寶楓就是其中值得深入研究的一個樹種。元寶楓（Acer truncatum Bunge），為槭樹科（Aceraceae）槭樹屬的落葉喬木，其種內(nèi)葉色、葉形變異廣泛，但是，在華北、華東的城市園林中，多數(shù)元寶楓植株的葉色表現(xiàn)一般，而‘魯紅 1 號’是課題組經(jīng)多年研究選育出的元寶楓的一個品系，其秋葉鮮紅，紅葉持續(xù)的時間很長，觀賞價值高，更適合作庭蔭樹、行道樹或風景林樹種。目前，我國對彩色葉植物的研究處于初級階段。對它的研究主要集中在栽培和開發(fā)利用方面，分子生物學方面的研究很少，沒有完整的分子層面上的研究體系，嚴重阻礙了彩葉植物在葉色方面分子育種的研究進程。‘魯紅 1 號’為開展元寶楓分子生物學研究提供了優(yōu)良試材，通過對其葉片色彩表達的分子機理研究，為槭屬彩葉品種的分子育種、為彩色葉植物的人工調(diào)控葉色、定向培育彩色葉植物奠定基礎。

1.1植物花色苷的研究進展
花色苷廣泛存在于植物中，是決定植物花、果實和葉片等的顏色的重要色素之一。花色苷是苯丙氨酸代謝途徑的產(chǎn)物，它是一類水溶性色素，在細胞質(zhì)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中合成，運輸?shù)揭号莺螅尸F(xiàn)出紅色、黃色、藍色和紫色等豐富的色彩（Gillian，2001；Martin et al.，1993）�；ㄇ嗨剀湛烧T導根瘤菌，，抑制病蟲害，吸引昆蟲傳粉，使果實免受紫外光傷害等，花色素苷又有抗氧化、抗動脈硬化、延緩衰老的作用（Kramer et al.，2004；Nakaishi et al.，2000；Tsuda et al.， 2003），人體保健功能也備受人們注視。
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1.2葉色基因工程及展望
花色苷生物合成的結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子的深入研究，為類黃酮代謝途徑的各支路工程開展奠定了扎實的基礎，且取得了矚目的成績，尤其是將基因工程技術應用于觀賞植物花色的分子育種（即花色基因工程）更是取得了巨大的成功，相對于成功進入市場的轉(zhuǎn)基因花卉來說將基因工程技術應用于彩葉植物葉色的分子育種還處于起步階段，并且相對于花瓣來說葉片的呈色機理和調(diào)控機理更復雜得多，這就更不利于葉色基因工程的進展。目前為止，仍未見應用。至今，國內(nèi)外對具有較高經(jīng)濟價值及廣泛園林用途的彩色葉植物的葉色呈色機理研究報道較少。因此，從分子方面研究彩色葉植物葉色的呈色機理具有重要的理論意義及實際價值。進而在葉片呈色的分子機理研究的基礎上，借鑒類黃酮和花色基因工程的一些策略，可以有目的開展葉色基因工程。具體的可以從這些方面入手：研究影響葉色呈色的生理生化機制，從分子生物學的角度研究彩葉變色過程中的結(jié)構(gòu)基因的表達變化，進行葉色的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及定向分子育種的研究，使常綠樹種形成彩葉，并繁殖和培育出更多豐富多彩的彩色葉植物。這將是今后彩色葉植物重要的研究內(nèi)容，也將是彩色葉植物廣泛應用于城市園林綠化的基礎。
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2材料與方法

2.1材料
2.1.1植物材料
本試驗的供試材料包括‘魯紅1號’原株及其自由授粉子代家系，以普通元寶楓為對照�！敿t1號’為課題組選育的秋葉鮮紅的元寶楓新品系，位于山東農(nóng)業(yè)大學試驗基地；其家系對比試驗林設在濟南百合園林集團的苗圃中，實驗林始建于2010年春，現(xiàn)已經(jīng)達5年，長勢良好。

2.1.2 菌株及載體
本實驗研究用的大腸桿菌DH5a菌株和基因克隆載體pMD18-T Vector均購自于大連寶生物生物工程有限公司。

2.1.3試劑盒、生化試劑
TRIZOL試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；EASY spin Plus 植物RNA快速提取試劑盒購自于北京艾德萊生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒（DP209-02）北京天根生化科技有限公司；MightyAmp? DNA Polymerase Ver.2 試劑盒、EasyTaqTM First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒均購自北京全式金生物技術 有 限 公 司 ； 5′ RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends,Version 2.0（18374-058）試劑盒購自Invitrogen公司；SMARTer? RACE cDNA Amplification Kit（634923）試劑盒購自Clontech 公司。實驗研究過程中所用的試劑DEPC 、CTAB、EDTA-Na2?2H2O、Tris、PVP、β-巰基乙醇、SDS、EB、Amp、IPTG、X-gal、瓊脂糖、瓊脂粉、酵母粉、胰蛋白胨等純試劑均購于大連寶生物工程有限公司；DL2000 分子 Marker購自北京全式金生物技術有限公司；CaCl2、甲醇、LiCl、NaCl、NaAc、NaOH、冰乙酸、濃鹽酸、氯仿、異戊醇、無水乙醇等試劑均購自北京索萊寶生物工程有限公司；部分水是用超純水。
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2.2方法
參照王慧聰?shù)龋ㄍ趸勐數(shù)龋?004）的方法，以株為實驗單元，每個時間段每株樹分別采集葉片，采集后，立即用冰盒帶回實驗室。將葉片切碎混勻，取 0.5 克葉片于離心管，加10ml1%Hcl/甲醇溶液，放于 4℃冰箱中浸提 2h。用分光光度計測各提取液在553nm 和 600nm 處的吸光值。以每克葉片質(zhì)量的提取液的光密度變化值D553nm-D600nm=0.01 作花色苷單位，用 U 表示。核酸蛋白分析儀檢測：取1μl RNA樣品，用ND-2000核酸蛋白分析儀進行含量以及純度的測定。電泳檢測：（1）稱0.2g瓊脂糖于容器中，加入20ml電泳緩沖液，加熱溶解，冷卻到60℃時加入0.5μl的EB染色。（2）將凝膠液倒入槽中，約凝固半個小時。（3）待膠凝好之后拔出梳子，將膠放入電泳槽中，點樣（5ul RNA+1μl 6×Loading Buffer）（4）在和l×TAE緩沖液下，10 V/cm 穩(wěn)壓條件下電泳15 min，對RNA純度和完整性進行電泳檢測。
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3 結(jié)果與分析.....26
3.1‘魯紅 1號’葉片花色苷含量及葉色......26
3.2‘魯紅 1號’自由授粉子代的葉色表現(xiàn).........27
3.3‘魯紅 1號’ MYB 轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆......31
3.3.1‘魯紅 1號’葉片總 RNA 的質(zhì)量與產(chǎn)率....31
3.3.2 ‘魯紅 1號’ MYB 轉(zhuǎn)錄因子基因的分離.........32
3.3.2.1 MYB轉(zhuǎn)錄因子基因 cDNA 的全長..... 33
3.3.2.2 核酸序列分析......34
3.3.2.3 MYB轉(zhuǎn)錄因子基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測........36
3.3.2.4氨基酸序列的進化樹分析.......36
4 討論..........38
4.1‘魯紅 1號’葉片花色苷含量及葉色......38
4.2‘魯紅 1號’葉色性狀的遺傳模式..........38
4.3‘魯紅 1號’葉片總 RNA 提取.........39
4.4 ‘魯紅 1號’MYB 轉(zhuǎn)錄因子基因....40
5 結(jié)論與創(chuàng)新點........42
5.1結(jié)論.......42
5.2創(chuàng)新點..........42

4討論

4.1‘魯紅 1號’葉片花色苷含量及葉色

花色苷廣泛存在于植物體內(nèi)，是決定植物的葉、花、果實等顏色的重要因素之一�；ㄉ盏纳锖铣沙耸苷{(diào)控基因和結(jié)構(gòu)基因的協(xié)同調(diào)節(jié)之外，還受到內(nèi)在激素和外在環(huán)境的影響，同時外在環(huán)境影響因素主要包括光照和溫度。各種樹在秋末的時候花色苷含量均在不同程度上逐漸升高,這是因為溫度不僅在基因轉(zhuǎn)錄水平上影響花色苷的生物合成，也對花色苷的穩(wěn)定有影響，而低溫會誘導與花色苷合成相關的基因表達，從而使花色苷含量升高。在彩色葉植物的葉片漸漸趨于衰老過程中,花色苷含量升高能夠起到保護葉片細胞和光合結(jié)構(gòu)的作用。葉片的色澤在花色苷種類一定的條件下，主要受到花色苷的含量的影響。葉片中花色苷含量與葉片的轉(zhuǎn)色過程有密切關系，且不同的種、品種之間存在著一定差異。本試驗結(jié)果顯示：花色苷的積累與葉片的發(fā)育過程密切相關：伴隨著葉片的發(fā)育‘魯紅1號’葉片中的花色苷的含量在轉(zhuǎn)色盛期達到高峰，之后伴隨著葉片的衰老花色苷的含量逐漸降低，同時葉片的顏色由最初的淡紅色到深紅色最后變?yōu)榘导t色（如附圖說明中的圖1、2、3、4）。其它兩種對照元寶楓的葉片花色苷含量變化趨勢與‘魯紅1號’的無異，‘魯L-2’植株葉片中花色苷含量只是在原來的基礎上有著輕微的變動，‘魯紅1號’葉片中花色苷的含量遠遠高出于其它兩種對照元寶風的含量。顯示在葉色上就表現(xiàn)為‘魯紅1號’秋季葉片的葉色比‘魯C-1’和‘魯L-2’的要紅的多（如附圖說明中的圖1、2、3、4、5、6）。由此我們推測，‘魯紅1號’葉片的呈色差異在于花色苷積累的多少。

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結(jié)論

本研究主要以‘魯紅1號’及其自由授粉子代家系為研究材料，測定了花色苷含量及從連續(xù)5年的秋季葉片葉色參數(shù)，提取秋季葉片總 RNA，并通過 PCR成功的克隆了MYB轉(zhuǎn)錄因子基因。本研究的主要結(jié)論如下：
1. ‘魯紅1號’葉片花色苷的含量在轉(zhuǎn)色期呈先上升后下降的趨勢，且是對照的兩倍還要多，且其葉片花色苷的含量與葉色參數(shù)a呈正相關。
2.‘魯紅1號’自由授粉子代在秋季轉(zhuǎn)色期有90%左右的個體葉色呈紅色或偏紅，年度間較穩(wěn)定，具有顯性特征，推測屬于核基因控制。
3.建立了改良 CTAB 法提取‘魯紅1號’葉片總 RNA，提取的總 RNA 純度高、濃度大，達到 RT-PCR 及建立文庫的要求，同時該方法也為其它多糖多酚植物的總 RNA提取提供借鑒。
4. 克隆了MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，經(jīng)氨基酸比對、進化樹分析、生物信息分析結(jié)果都證實了MYB屬 R2R3MYB 類轉(zhuǎn)錄因子，推測具有調(diào)控‘魯紅1號’花色苷生物合成的功能。該MYB轉(zhuǎn)錄因子基因被命名為LH-MYB。
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參考文獻(略)

本文編號：38865