為了快速鑒定昆蟲病原線蟲,同時驗證實驗室多年保存的昆蟲病原線蟲種或品系間的差異,采用線蟲保守區(qū)間核糖體DNA （r DNA,18S-ITS1-5.8S-ITS2-28S）的PCR擴增和測序分子鑒定方法,對13個線蟲種和品系的18S-28S r DNA和28S r DNA （D2-D3）進行擴增并對序列進行比較和分析,研究斯氏屬（Steinernema）和異小桿屬（Heterorhabditis）線蟲的r DNA保守區(qū)域是否和已報道的線蟲相同。結果表明,28S r DNA的D2-D3的擴增序列比對的分子數據和形態(tài)學鑒定的結果完全一致,且與基因庫已報道的線蟲種相似度達到99%～100%,能明顯區(qū)分線蟲屬、種或者品系。18S-ITS1-5.8S的序列能夠區(qū)分S.glaseri和S.carpocapsae,但不能區(qū)分序列相近的S.litorale和S.feltiae,需要內轉錄間隔區(qū)ITS2來區(qū)分。因此,r DNA能被用于快速分類鑒定昆蟲病原線蟲的種和品系。 

【文章來源】：土壤與作物. 2020,9(04)

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【部分圖文】：

種昆蟲病原線蟲28S r DNA的D2-D3區(qū)域系統發(fā)育樹

昆蟲病原線蟲一些種類GC含量有明顯不同，例如，線蟲S.glaseri的28S r DNA D2-D3序列的GC含量無論是ITS還是D2-D3區(qū)域明顯高于其它斯氏屬線蟲，而S.carpocapsae的GC含量明顯低于其它斯氏屬線蟲。有趣的是，S.glaseri的體長明顯大于其它Steinernema spp.,S.carpocapsae的體長明顯小于其它幾個斯氏線蟲，S.litorale和S.feltiae的體長非常相近[34]，難以區(qū)分，而GC含量也非常接近，可以看出分子手段和形態(tài)學鑒定結果有很好的一致性。形態(tài)學的鑒定非常重要，但費時費力，該研究表明分子方法可以初步快速確定未知線蟲的屬或種，結合形態(tài)學方法更準確地鑒定到種和品系，也可以用分子方法快速驗證已知線蟲的屬或種。另外，我們利用PCR產物進行測序，沒有克隆ITS和D2-D3的完整序列，但這些數據足以準確鑒定昆蟲病原線蟲到種，且根據序列堿基差異還能表明同種不同品系間存在DNA差異。而克隆這些基因從時間上要求更長，技術和成本上都要求很高，因此利用PCR產物直接測序是非常經濟有效的。圖3 H.bacteriophoris (Hb)、S.feltiae (Sf)和S.litorale (Sl) D2-D3和ITS r DNA區(qū)域變異序列比對

圖2 6種昆蟲病原線蟲18S-28S核糖體r DNA的ITS區(qū)域系統發(fā)育樹目前，我們在黑龍江省內分離到的線蟲多數是S.feltiae，檢出率明顯高于其它種，這個線蟲比較耐低溫，在俄羅斯、加拿大、芬蘭、瑞典、北愛爾蘭等多國寒冷地區(qū)均有分布[35]，該線蟲發(fā)生在我國東北，與前人報道的寒冷氣候比較相符。分離本地昆蟲病原線蟲資源，對于控制本地害蟲非常重要。對于分布在寒帶和溫帶的昆蟲病原線蟲，只有安全越冬，其種群才能得以存活和繁衍。由于本土線蟲群體對本土適應性強，有利于線蟲在土壤中定居、種群建立以及發(fā)揮持效性，所以篩選本土昆蟲病原線蟲是提高其防治效果的最佳途徑。因此，線蟲S.feltiae將對低溫土壤害蟲的生物防治應用提供很好的材料。因種內不同分離地的品系形態(tài)上沒有差異，但對寄主和寄主棲境的識別能力有差異，對寄主的侵染能力也有差異[20-22]，本研究所檢測到種內r DNA的序列差異與它們對寄主毒力的不同可能有一定關系，但相關性還需要進一步研究，種內堿基變異將為線蟲的進化提供理論依據。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]昆蟲病原線蟲對舞毒蛾幼蟲的侵染能力[J]. 滑莎,趙紅盈,王從麗,王鑫鵬,李春杰.  東北林業(yè)大學學報. 2018(05)
[2]黑龍江省大慶市大棚蔬菜根結線蟲種類和小種的鑒定[J]. 李春杰,胡巖峰,王從麗.  土壤與作物. 2016(02)
[3]黑龍江省昆蟲病原線蟲資源和越冬情況調查初報[J]. 李春杰,譚國忠,王義,許艷麗.  植物保護. 2011(02)
[4]蕪菁夜蛾斯氏線蟲G26侵染期幼蟲cDNA文庫的構建及表達序列標簽分析[J]. 馬娟,張軍鴿,李秀花,李敏權,陳書龍.  華北農學報. 2008(06)
[5]河北省昆蟲病原線蟲資源調查[J]. 陳書龍,李秀花,史均環(huán).  中國生物防治. 2006(01)
[6]河北省異小桿類昆蟲病原線蟲種類鑒定[J]. 陳書龍,李秀花,Maurice Moens.  華北農學報. 2005(05)
[7]昆蟲病原線蟲rDNA多態(tài)性分析[J]. 丘雪紅,韓日疇,許再福.  昆蟲天敵. 2003(03)
[8]ITS-RFLP分析進行昆蟲病原線蟲斯氏屬和異小桿屬的分類鑒定[J]. 李菁菁,韓日疇,曹莉,劉秀玲,彭統序,李麗英.  昆蟲天敵. 2002(03)
[9]小卷蛾斯氏線蟲不同品系RAPD分析及親緣關系研究[J]. 周燚,簡恒,王中康.  寄生蟲與醫(yī)學昆蟲學報. 2002(02)
[10]北京地區(qū)昆蟲病原線蟲的自然發(fā)生情況初步調查[J]. 張剛應,楊懷文,張善稿,簡恒.  生物防治通報. 1992(04)



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