聯(lián)苯的氯代衍生物多氯聯(lián)苯(PCBs)是廣泛應用的重要工業(yè)原料。它是一種嚴重的環(huán)境污染物,對人類有致癌作用。多氯聯(lián)苯的微生物好氧降解是通過聯(lián)苯代謝途徑進行的。聯(lián)苯的上游代謝途徑需要四個酶的參與,其中2,3-二羥基聯(lián)苯雙加氧酶(BphC)屬于外部雙加氧酶的一種,它在聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯的降解中是一個非常關鍵的酶,其結構,功能和底物特異性等方面已成為該領域研究的熱點。 Rhodococcus sp. R04基因組測序發(fā)現,該基因組中含有8個bphC基因,分別命名為bphCl至bphC8�；诎被嵝蛄械南嗨菩院屯獠侩p加氧酶的分類,BphCl, BphC2, BphC3, BphC8屬于類型I, BphC4, BphC5, BphC6, BphC7屬于類型Ⅱ。8個BphC之間的氨基酸序列相似性為11%～77%。根據全基因組序列設計引物,從Rhodococcus sp. R04基因組中擴增出8個bphC基因,將它們分別克隆到表達載體pBV220-His中,并獲得了表達。用離子交換一步層析,獲得了電泳純的BphC8, SDS-PAGE和分子排阻層析表明它是一個亞基分子量為35KD左右的同源六聚體。最適溫...

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【學位級別】：碩士

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中文摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1 2,3-二羥基聯(lián)苯雙加氧酶的概況
        1.1 雙加氧酶概述
        1.2 外部雙加氧酶的分類
        1.3 2,3-二羥基聯(lián)苯雙加氧酶的結構
        1.4 2,3-二羥基聯(lián)苯雙加氧酶的催化機制
    2 2,3-二羥基聯(lián)苯雙加氧酶的多樣性
        2.1 不同微生物中BphC的多樣性和功能
        2.2 BphC的一級結構比較
        2.3 BphC的二級結構比較
    3 2,3-二羥基聯(lián)苯雙加氧酶的聚合形態(tài)
        3.1 不同菌種中BphC的聚合形態(tài)
        3.2 包涵體組成成分
        3.3 包涵體形成原因
        3.4 包涵體特點
        3.5 包涵體研究進展
    4 本論文研究的目的和意義
    參考文獻
第二章 Rhodococcus sp.R04中2,3-二羥基聯(lián)苯1,2-雙加氧酶多樣性
    1 材料
        1.1 菌株和載體
        1.2 培養(yǎng)基
        1.3 主要的酶和化學試劑
        1.4 主要儀器設備
    2 方法
        2.1 Rhodococcus sp.R04中8個BphC基因的序列分析
        2.2 Rhodococcus sp.R04中8個BphC一級結構序列比對
        2.3 建立系統(tǒng)發(fā)育樹
        2.4 Rhodococcus sp.R04中8個BphC基因的克隆
        2.5 8個BphC基因的表達
    3 結果
        3.1 Rhodococcus sp.R04中8個BphC基因的序列分析
        3.2 Rhodococcus sp.R04中8個BphC一級結構序列比對分析
        3.3 BphC系統(tǒng)發(fā)育分析
        3.4 Rhodococcus sp.R04中8個BphC基因的擴增及重組子的鑒定
        3.5 8個BphC的表達
    4 討論
    參考文獻
第三章 具有活性的BphC2包涵體及其生化特性
    1 材料
        1.1 菌株和載體
        1.2 培養(yǎng)基
        1.3 主要的酶和化學試劑
    2 方法
        2.1 Rhodococcus sp.R04中2,3-二羥基聯(lián)苯雙加氧酶基因bphC2的克隆
        2.2 BphC2的表達
        2.3 可溶性BphC2的純化
        2.4 包涵體的純化
        2.5 酶活及蛋白含量測定
        2.6 純化的可溶性BphC2和包涵體的化學修飾
        2.7 純化的可溶性BphC2和包涵體的熱穩(wěn)定性測定
        2.8 具有活性包涵體的酶活性與濁度測定
        2.9 HOPDA的熒光共譜掃描
        2.10 DeltaVision觀察宿主菌中包涵體的位置
    3 結果
        3.1 Rhodococcus sp.R04中bphC2的擴增及重組子的鑒定
        3.2 BphC2的表達
        3.3 可溶性BphC2的純化
        3.4 包涵體的純化
        3.5 化學修飾劑對純化的可溶性BphC2和包涵體酶活的影響
        3.6 純化的可溶性BphC2和包涵體的熱穩(wěn)定性
        3.7 具有活性包涵體的酶活性與濁度的比值
        3.8 HOPDA的熒光共譜分析
        3.9 確定誘導后的宿主菌中包涵體的位置
    4 討論
    參考文獻
第四章 截短型BphC2的表達純化和部分性質研究
    1 材料
        1.1 菌株和載體
        1.2 培養(yǎng)基
        1.3 主要的酶和化學試劑
    2 方法
        2.1 C-端截短型bphC2的克隆
        2.2 突變體重組質粒的構建
        2.3 C-端截短型BphC2的表達
        2.4 C-端截短型BphC2的純化
        2.5 酶活性測定
        2.6 蛋白濃度測定
        2.7 突變酶的熱穩(wěn)定性測定
        2.8 突變酶寡聚體分析
    3 結果
        3.1 C-端截短型bphC2的克隆
        3.2 C-端截短型bphC2的表達
        3.3 C-端截短型BphC2的純化
        3.4 野生型BphC2₂₉₅和突變酶的動力學常數
        3.5 突變酶的熱穩(wěn)定性變化
        3.6 突變酶的分子形式
    4 討論
    參考文獻
第五章 Rhodococcus sp.R04 BphC8的純化和部分性質研究
    1 材料
        1.1 菌株和載體
        1.2 培養(yǎng)基
        1.3 主要化學試劑
    2 方法
        2.1 Rhodococcus sp.R04 BphC8的純化
        2.2 最適pH和pH穩(wěn)定性測定
        2.3 最適溫度和熱穩(wěn)定性測定
        2.4 天然分子量的測定
        2.5 金屬離子和某些化合物對BphC8酶活性的影響
        2.6 動力學參數的測定
        2.7 圓二色性分析
    3 結果與分析
        3.1 Rhodococcus sp.R04 BphC8的純化
        3.2 BphC8最適pH和pH穩(wěn)定性測定
        3.3 BphC8最適溫度和熱穩(wěn)定性測定
        3.4 BphC8的天然分子量的測定
        3.5 金屬離子和某些化合物對BphC8酶活性的影響
        3.6 BphC8對不同底物的動力學參數
        3.7 BphC8的圓二色性
        3.8 Rhodococcus sp.R04中三個BphC的比較
    參考文獻
小結
攻讀學位期間取得的研究成果
致謝
個人簡況及聯(lián)系方式



本文編號：3897089