本文關鍵詞：尿液exosomes的分離、富集、純化及其內(nèi)部蛋白指紋圖譜分析

  更多相關文章： 尿液exosomes Tamm-Horsfall蛋白 還原反應 烷基化反應 酶解反應 蛋白質組學 質譜分析

【摘要】：研究背景1987年,Johnstone等在研究網(wǎng)織紅細胞的成熟過程中,通過羊網(wǎng)織紅細胞體外培養(yǎng)的上清超速離心后,收集到一種直徑60 nm的囊性小泡,其將這些納米級的小囊泡即命名為exosomes。 exosomes由脂質雙分子層、跨膜蛋白、1mRNAs和microRNAs組成,密度在1.13ug/ml到1.19g/ml之間,在電子顯微鏡下呈杯狀。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)上皮細胞、成纖維細胞、肥大細胞、抗原提呈細胞、腫瘤細胞、肝細胞、腸上皮細胞、血小板、等多種細胞都能釋放exosomes o人體生理體液,包括血液、尿液、母乳、羊水、精液、唾液、關節(jié)滑液、胸腹水、肺泡沖洗液、等中也都存在exosoemso exosomes被釋放到細胞外不僅僅是為了單純地清除細胞內(nèi)廢棄的蛋白,它還參與了細胞間的通訊。其能夠作為細胞間的載體,傳遞生物的生理和病理信息,參與了多種不同的生理及病理過程。不同細胞來源的exosomes含有不同的分子組成,也具有與其來源細胞相似或相同的生物學功能。同樣,exosomes中細胞特異性蛋白的存在也可以反應其來源細胞及其功能。目前對exosomes的研究不僅僅在其功能方面,更是到實際的應用—即診斷和治療方法方面的開發(fā)。鑒于exosomes含有大量的轉運蛋白、mRNA、microRNA等生物信息,能調節(jié)免疫反應、血管新生、細胞增殖以及腫瘤細胞侵襲,其可以作為非常理想的生物標記物來源,有望在多種疾病的早期診斷中發(fā)揮作用。目前也有不少關于對血液、尿液、唾液等exosomes勺研究發(fā)現(xiàn)了多種疾病的生物標記物,有望對指導疾病的早期與個體化治療帶來新的希望。2004年,Pisitkun等首先報道在尿液中發(fā)現(xiàn)并分離出exosomes。人體尿液中含有大量的exosomes,其可以由泌尿系統(tǒng)(包括腎臟、膀胱、前列腺)的所有上皮細胞釋放進入尿液。尿液exosoems與其它類型的exosomes一樣,攜帶大量來源細胞的信息,十分有利于探索特定細胞的生理功能與病理變化。通過蛋白組學等方法人們已經(jīng)在分離出的正常人尿液exosomes中鑒定出超過1000種蛋白質。尿液相對于其它體液具有無創(chuàng)、大量的獨特優(yōu)點,對泌尿系統(tǒng)疾病的早期診斷生物標記物、治療和監(jiān)測的靶點以及疾病的發(fā)病機制等研究具有極大的意義。近年來的一些研究發(fā)現(xiàn),尿液exosomes蛋白譜的變化可以反映某些特定的腎臟病變情況。Exosomes可以攜帶信息穿梭于腎臟細胞之間,改變受體細胞蛋白譜與功能,這可能代表著一種腎單位內(nèi)細胞與細胞間的信號傳遞機制。近年來結合尿exosomes分離技術及先進的蛋白質組學技術已經(jīng)檢測出不少腎臟結構與功能損害相關的尿exosomes生物標記物。尿液exosomes的發(fā)現(xiàn)對糖尿病腎病發(fā)病機制、早期診斷和監(jiān)測標記物的研究帶來了新的方向。最近(2014年)Zubiri I等發(fā)表在《J Protromics》上的論文報道其在對糖尿病腎病患者尿液exosomes質譜分析結果,其首先比較了兩種目前常用的尿液exosomes分離富集方法,然后選擇較適宜的方法進行液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)分析。結果顯示AMBP、MLL3、 VDAC1這三種蛋白在糖尿病腎病與正常組尿液exsomes中表達差異,可以作為糖尿病腎病早期診斷的備選生物標記物。除上述研究外,還有尿exosomes用于急性腎損傷、多囊腎、腎臟纖維化、膀胱癌等疾病的報道。尿液exosomes給腎臟病等泌尿系統(tǒng)疾病的研究帶來了極大的前景,但日前還處于初期階段,很多研究中面臨的問題與挑戰(zhàn)有待解決。首當其沖的就是尿液exosomes的分離、富集和純化問題。到目前為止還沒有統(tǒng)一的得到一致認可的標準方法。目前國際上主要使用的分離、富集方法有兩大類：一種以超速離心為基礎,第二種方法是以納米膜離心超濾為基礎,但這兩種主要的方法均有缺點。另外目前所有尿液exosomes富集與純化過程中而臨的另外一個非常棘手的問題就是正常人尿液中大量存在的Tamm-Horsfall蛋白(THP)的干擾。THP在尿液中聚合成幾微米長的雙螺旋繩索樣結構,將很多exsomes包裹其中,在分離exosomes時這些THP蛋白同時沉淀下來,從而會影響后續(xù)的exosomes蛋白質組學分析。目前尚無研究報道可以在exosomes中完全消除THP等外部蛋白的干擾從而使尿exosoems得到完全的純化。缺乏尿液exosomes相關檢測指標(如內(nèi)部某種蛋白生物標記物)的標準化方法也是影響后續(xù)臨床應用的一個問題。不同尿液標本稀釋程度的差異決定了不能直接以實際測得的尿液exosomes相關指標來作正常與異常的比較。臨床上目前應用尿肌酐來校正尿白蛋白濃度的方法欠準確,而應用exosomes本身的標記物蛋白如TSG101或者Alix蛋白來校正的方法又比較復雜,過程較慢。因此有必要尋求一種較簡單、實用的exosomes相關標準化指標。本研究團隊經(jīng)過兩年的前期研究創(chuàng)立了一種新的exosomes分離、富集方法-“液壓透析法(hydrostatic dialysis)'’。該方法具有設備簡單、成本低、處理量大,尿液中干擾性的可溶性蛋白有效清除,排除個體間exosomes外其它因素差異對后續(xù)生物學分析的影響(如不同尿液來源的酸堿程度差異在本方法處理后處在同一PH水平),最大程度減少了exosomes的損失,而且可以與超速離心、超濾方法上述兩種分離、富集方法相結合用于不同目的的研究等主要優(yōu)點。該方法在大規(guī)模推廣應用前需要進一步通過中國人群不同腎病程度的尿液標本來驗證該方法的可重復性與有效性。另外我們將在此方法分離、富集尿液exosomes基礎上探討可作為尿液exosomes成分標準化的候選指標。同時,進一步應用還原、烷基化、Trypsin酶解等方法探索對尿液exosomes的完全純化(即完全清除exosomes外的干擾蛋白)。在純化的尿液exosomes基礎上,通過質譜分析了解尿液exosomes內(nèi)部蛋白指紋圖譜。方法1.尿液標本的選取與收集“液壓透析法”驗證研究標本從-80℃超低溫冰箱所保存的中國人群尿液樣本庫中選取,包括正常人群組、前驅糖尿病組、糖尿病無蛋白尿組、糖尿病微量白蛋白尿組、糖尿病大量蛋白尿組尿液樣本。標準化、純化及質譜分析研究選取都柏林城市大學健康志愿者提供的尿液標本。所有入組對象均簽署經(jīng)都柏林城市大學國家生物傳感器中心倫理委員會批準的知情同意書。收集研究對象晨起第一次尿液樣本,不添加蛋白酶抑制劑及防腐劑,2小時內(nèi)送實驗室處理。2.“液壓透析法”尿exosomes的分離、富集尿液標本先室溫下2000g離心30分鐘,除去細胞、細胞碎片、及部分Tamm-Horsfall蛋白。一上清液通過自行設計的液壓透析裝置進行exosomes分離、富集：檢查裝置連接良好后,將尿液標本倒入該裝置,待樣品濃縮至6-8ml時,加入200ml miliQ水,沖洗1000KD透析膜。待樣品進一步濃縮至6-8ml時收集1000KD透析膜內(nèi)的液體(↑1000KDa fraction).3.尿exosomes的鑒定透射電子顯微鏡觀察“液壓透析法”分離、富集的1、1000KDa部分液體中是否存在囊泡,囊泡的形狀、大小。通過western blot檢測尿exosomes自身的標記物TSG1O1。4.探討尿液exosomes相關標準化(量化)指標探討Tamm-Horsfall蛋白以及白蛋白這兩種指標在尿液exosomes相關檢測結果標準化的應用可行性。10位健康人尿液“液壓透析法”富集的尿液exosomes樣品(↑1000KDa),通過western blot技術在同一塊膜上檢測Tamm-Horsfall 蛋白與TSG101蛋白熒光信號以及白蛋白與TSG101蛋白熒光信號,利用Odyssey掃描系統(tǒng)自帶的軟件定量分析熒光信號強度。使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包對10份樣品的灰度值數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。應用Spearman秩相關系數(shù)來分析THP與TSG101灰度值,以及Albumin與TSGIO1灰度值之間的相關關系,以p0.05為差異有統(tǒng)計學意義。5.還原與烷基化反應對尿液exosomes外部干擾蛋白的去除Tamm-Horsfall蛋白的多聚體結構中富含二硫鍵。利用還原與烷基化試劑對二硫鍵破壞,觀察其對尿液exosoems外部干擾蛋白(特別是Tamm-Horsfall蛋白的降解與清除情況)以及對exosomes的影響,為exosomes的純化研究提供指導。6. Trypsin酶解反應對尿液exosomes外部干擾蛋白的去除及exosomes的純化對尿液“液壓透析法”富集的尿液exosomes樣品(↑1000KDa)進行還原、烷基化及蛋白酶Trypsin酶解反應。將外部的蛋白(特別是Tamm-Horsfall蛋白)分解成肽段,再經(jīng)過截留分子量為30KD的超濾裝置進行分離。利用凝膠考馬斯亮藍染色、western blot及透射電鏡觀察Tamm-Horsfall蛋白的分解及清除情況,以及對exosomes本身的影響。7.在尿液exosomes純化的基礎上對exosomes內(nèi)部蛋白指紋圖譜的分析對尿液“液壓透析法”富集的尿液exosomes樣品,利用上述方法進行exosomes純化。然后使用去污劑脫氧膽酸鈉破壞exosomes外膜,暴露exosomes內(nèi)部成分,再進行還原、烷基化及Trypsin酶解蛋白,利用質譜分析了解exosomes內(nèi)部蛋白指紋圖譜。結果1.新型尿液exosomes分離、富集技術的驗證中國人群不同腎臟病變程度尿液樣品通過“液壓透析法”均可有效分離、富集exosomes,體現(xiàn)了很好的重復性和穩(wěn)定性。透射電鏡下可以觀察到↑1OOOKDa樣品中散在分布的大小不等的囊泡,囊泡主要的直徑范圍為40-1 OOnrn,最小的囊泡直徑為20-30nm,最大的囊泡直徑可為400nm 。 Western blot檢測到exosomes自身的標記物TSG101陽性,表明尿exosomes富集過程中exosomes未受到破壞。2.尿液exosomes相關標準化(量化)指標通過Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描后的圖像通過Quantity-One圖像分析軟件掃描計算出條帶平均灰度值。Spearman秩相關系數(shù)的分析結果顯示Tamm-Horsfall蛋白與TSG101熒光強度相關系數(shù)r=0.842,p=0.002,兩者之間具有正相關關系。3.還原與烷基化反應對尿液exosomes外部干擾蛋白的去除凝膠考馬斯亮藍染色及western blot結果顯示,還原與烷基化反應后exosomes外Tamm-Horsfall蛋白部分降解,但兩種還原及烷基化試劑在不同速度離心下均不能完全消除Tamm-Horsfall蛋白對exosomes的影響。4.Trysin酶解反應對尿液exosomes外部干擾蛋白的去除及exosomes的純化凝膠考馬斯亮藍染色及western blot結果顯示,還原、烷基化基礎上的Trypsin酶解反應,可將exosomes外Tamm-Horsfall蛋白完全降解。通過截留分子量為30KD的超濾裝置可清除已降解的肽段,實現(xiàn)exosomes的純化。整個過程中exosomes未受到破環(huán)。5.在尿液exosomes純化的基礎上對exosomes內(nèi)部蛋白指紋圖譜的分析在上述純化的exosomes的基礎上,對exosomes內(nèi)部成分進行MS/MS分析,結果共鑒定出exosomes內(nèi)部942種蛋白質并對鑒定的蛋白進行了細胞組分、分子功能與生物過程的分析。結論1.本研究團隊所發(fā)明的“液壓透析法”能夠很好地分離、富集尿液中的exosomes有著良好的重復性和穩(wěn)定性,適用于不同的實驗室、不同的人群以及不同的尿液病理狀態(tài),是一種值得廣泛推廣應用的技術方法。2.Tamm-Horsfall蛋白可以作為檢測尿液exosomes相關生物標記物的候選標準化(量化)指標。3.應用還原、烷基化及Trypsin酶解反應結合超濾裝置能實現(xiàn)尿液exosomes的純化,再此基礎上鑒定可靠的exosomes內(nèi)部蛋白質圖譜。4.本研究建立了一套從尿液收集,到尿液exosomes分離、富集、純化及蛋白質組學分析的一體化研究方法,為后續(xù)的疾病尿液exosomes生物標記物研究提供了指導。
【關鍵詞】：尿液exosomes Tamm-Horsfall蛋白 還原反應 烷基化反應 酶解反應 蛋白質組學 質譜分析
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R446.12
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-21
• 前言21-30
• 第一章 新型尿液exosomes分離、富集技術的驗證30-47
• 1. 材料與方法30-38
• 1.1 實驗材料、試劑與儀器30-32
• 1.2 研究方法32-38
• 2. 結果38-45
• 2.1 蛋白濃度38-40
• 2.2 SDS-PAGE凝膠電泳后銀染及Western blot結果40-43
• 2.3 透射電鏡43-45
• 3. 討論45-47
• 第二章 尿液exosomes標準化(量化)指標探討47-61
• 1. 材料與方法47-53
• 1.1 實驗材料、試劑與儀器47-49
• 1.2 研究方法49-53
• 2 結果53-58
• 2.1 Tamm-Horsfall蛋白與TSG101熒光條帶灰度值相關性53-55
• 2.2 Albumin與TSG101熒光條帶灰度值相關性55-58
• 3 討論58-61
• 第三章 尿液exosomes外部干擾蛋白去除及其純化61-88
• 第一節(jié) 不同還原劑與烷化劑對exosomes外干擾蛋白特別是THP的影響61-77
• 1 材料與方法63-70
• 2 結果70-76
• 3 討論76-77
• 第二節(jié) 還原與烷基化反應基礎上的Trypsin酶解對exosomes外干擾蛋白的清除以及exosomes的純化77-88
• 1 材料與方法78-84
• 2 結果84-86
• 3 討論86-88
• 第四章 在尿液exosomes純化的基礎上對exosomes內(nèi)部蛋白指紋圖譜的分析88-103
• 1 材料與方法88-94
• 2 結果94-101
• 3 討論101-103
• 參考文獻103-110
• 附錄1 英文縮略詞對照表110-112
• 附錄2 所發(fā)表的SCI論文112-150
• 攻讀學位期間成果150-154
• 致謝154-155

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本文編號：993708