本文關(guān)鍵詞：逍遙散調(diào)控海馬β-arrestin2介導(dǎo)的信號通路改善肝郁證的機(jī)制研究

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【摘要】：背景：肝郁證即肝氣郁結(jié)證,是指肝氣疏泄不及而產(chǎn)生的以氣機(jī)郁滯為特點(diǎn)的證候,它屬于中醫(yī)“郁證”的一種證型�！秲�(nèi)經(jīng)》中首次提出“郁”的概念,后世醫(yī)家又提出了五郁、六郁學(xué)說。肝郁,則是由五郁、六郁、情志致郁等逐漸演化過來的,將五氣之郁與臟腑之郁聯(lián)系起來。近年臨床流行病學(xué)資料顯示,在五臟病證中,中醫(yī)肝臟病證占總體病證的40%,而肝郁證作為肝臟病證的基本病理變化,可見于臨床各種疾病的初起階段。因此肝郁證一直是近年來中醫(yī)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。肝郁證的研究分臨床研究和動物實(shí)驗(yàn)研究,在其本質(zhì)研究方面,因許多臨床樣本的不可獲取性,動物研究更具優(yōu)勢。中醫(yī)證候動物模型的建立是中醫(yī)現(xiàn)代化研究的重要方法。在多種模型復(fù)制方法中,慢性不可預(yù)知溫和刺激法(chronic unexpected mild stress, CUMS)在國內(nèi)外的認(rèn)可度最高,它可以誘導(dǎo)動物的肝郁證表現(xiàn),其應(yīng)激因子的多樣性、溫和性和不可預(yù)知性很好地模擬了人類肝郁證的病因,且不會造成動物的軀體損害。肝郁證的方證研究也是其本質(zhì)研究的重要方面�！胺綇姆ǔ�,法隨證立”,辨證論治是中醫(yī)的核心。中醫(yī)證候研究具有以證選方、以方測證、方證互參的特點(diǎn),通過這一特點(diǎn),我們可以通過觀察某一證型在相應(yīng)方藥治療前后臨床癥狀的改善來反證辨證的準(zhǔn)確性。近年來對肝郁證本質(zhì)的研究頗多,已初步證實(shí)肝郁證具有現(xiàn)代病理生理學(xué)基礎(chǔ),認(rèn)為肝郁證是在抑郁、焦慮等不良心理應(yīng)激狀態(tài)下,出現(xiàn)高級神經(jīng)中樞調(diào)節(jié)功能的紊亂,進(jìn)而影響到神經(jīng)、免疫、消化、運(yùn)動、感覺等多系統(tǒng)而出現(xiàn)的病理改變和病證表現(xiàn)。近年來對應(yīng)激相關(guān)的下丘腦-垂體-腎上腺素皮質(zhì)系統(tǒng)和海馬突觸可塑性變化的研究較多,說明海馬在肝郁證的發(fā)病中起著重要作用。中醫(yī)證候是疾病發(fā)生和演變的過程中,某一階段中患者機(jī)體當(dāng)時(shí)所處的特定內(nèi)外環(huán)境的本質(zhì)反映。證候研究是中醫(yī)理論研究的一個關(guān)鍵問題,證候作為一種規(guī)律的病理表現(xiàn),必然存在其相應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ),但中醫(yī)證候錯綜復(fù)雜,如何運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)的方法來揭示其本質(zhì)是其研究的關(guān)鍵點(diǎn)。近年來,一門新興的學(xué)科-蛋白質(zhì)組學(xué)的出現(xiàn)為解決這一問題提供了一種新方法。蛋白質(zhì)組學(xué)是研究細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)表達(dá)方式和功能方式的一門學(xué)科,它從整體水平上來認(rèn)識生命現(xiàn)象,與中醫(yī)學(xué)的“整體觀念”類似。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)不是一成不變的,蛋白質(zhì)組作為所有蛋白質(zhì)的整合,也是不斷變化的。而中醫(yī)證候在疾病不同階段的病機(jī)和表現(xiàn)也是不同的,存在一定的演變規(guī)律,這些變化的物質(zhì)基礎(chǔ)可能就反應(yīng)在蛋白質(zhì)組的水平。將蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于中醫(yī)證候的研究中,不僅可以反應(yīng)不同癥狀的物質(zhì)基礎(chǔ),又可以了解不同蛋白質(zhì)組分在證的演變過程中發(fā)生的變異,通過對證候演變前后的蛋白質(zhì)組學(xué)研究對比來探究中醫(yī)證候的物質(zhì)基礎(chǔ)變化機(jī)制,揭示中醫(yī)證候的內(nèi)涵,可以為中醫(yī)的客觀化道路打下基礎(chǔ)。因此,本研究擬以海馬組織作為切入點(diǎn),提取其磷酸化蛋白質(zhì),通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法進(jìn)行差異蛋白質(zhì)的鑒定分析。并根據(jù)該蛋白分析結(jié)果的提示,引出肝郁證的關(guān)鍵信號分子及其介導(dǎo)的信號通路,進(jìn)行更深入的研究。同時(shí)選用中醫(yī)經(jīng)典抗肝郁方逍遙散進(jìn)行干預(yù),并以臨床經(jīng)典抗抑郁藥氟西汀(研究表明其可有效改善悶悶不樂,興趣減退等肝郁證癥狀)作為陽性對照藥,以期對海馬在肝郁證發(fā)病機(jī)制中的作用提供更進(jìn)一步的證據(jù),為繼續(xù)深入研究肝郁證的本質(zhì)奠定基礎(chǔ)。目的：采用CUMS聯(lián)合孤養(yǎng)的方法復(fù)制肝郁證大鼠模型,通過觀察模型大鼠的一般狀態(tài)、糖水消耗率及行為學(xué)指標(biāo)等評價(jià)模型的成功與否。然后用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法,對肝郁證模型大鼠海馬磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行差異表達(dá)分析,并根據(jù)分析結(jié)果的提示引出肝郁證的關(guān)鍵信號分子及其介導(dǎo)的信號通路并進(jìn)一步研究。試圖借助肝郁證大鼠模型,利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法找到肝郁證相關(guān)的特異性蛋白質(zhì),為中醫(yī)證候理論的研究找到相應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ),也可為肝郁證的臨床治療提供新思路,有望發(fā)現(xiàn)其治療的新靶點(diǎn)。并通過逍遙散和氟西汀對模型大鼠進(jìn)行干預(yù),發(fā)現(xiàn)其蛋白表達(dá)水平的差異,探討逍遙散改善肝郁證的作用機(jī)理,并利用中醫(yī)證候“以方測證,方證互參”的特點(diǎn),為肝郁證的本質(zhì)研究及治療提供新思路和新方法。方法：本研究在中醫(yī)證候理論指導(dǎo)下通過CUMS聯(lián)合孤養(yǎng)的方法復(fù)制肝郁證大鼠模型,采用中藥復(fù)方逍遙散進(jìn)行干預(yù),并應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法,以海馬組織為研究對象,找出模型組大鼠與對照組及逍遙散組大鼠海馬組織的差異表達(dá)蛋白點(diǎn),通過鑒定分析并引出肝郁證的關(guān)鍵信號分子及其介導(dǎo)的信號通路,采用免疫組化(Immunohistochemical, IHC)、免疫印跡(Western blot, WB)及熒光定量PCR (real-time polymerase chain reaction, RT-PCR)技術(shù)進(jìn)一步研究。1、CUMS聯(lián)合孤養(yǎng)的方法復(fù)制肝郁證大鼠模型動物分組及模型復(fù)制：清潔級雄性SD大鼠40只,體重200±20g,適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后隨機(jī)分為對照組、模型組、模型加逍遙散組(簡稱逍遙散組)、模型加氟西汀組(簡稱氟西汀組),每組10只。對照組5只一籠,其余三組單籠飼養(yǎng),并接受CUMS程序干預(yù),一周內(nèi)刺激方式隨機(jī)使用,連續(xù)三周。藥物干預(yù)：逍遙散組給予19 g/kg/d的逍遙散溶液,氟西汀組給予2 mg/kg/d的氟西汀混懸液,對照組和模型組均給予蒸餾水,按照10ml/kg灌胃,藥物總量按一日兩次分服。模型評價(jià)：通過對大鼠一般狀態(tài)的觀察、糖水消耗率及行為學(xué)檢測等判斷模型的可靠性。2、運(yùn)用HE染色和尼氏染色,觀察大鼠海馬組織的形態(tài)學(xué)變化。3、海馬磷酸化蛋白質(zhì)的2-DE分離及凝膠圖像優(yōu)化海馬磷酸化蛋白質(zhì)的2-DE分離,對同類混合樣本以組間配對的形式,同時(shí)進(jìn)行2-DE分離,并重復(fù)3次。2-DE分離獲得的凝膠,經(jīng)處理后掃描成圖像。用PDQuest7.0軟件分析凝膠圖像,獲取每個蛋白質(zhì)的表達(dá)量、等電點(diǎn)和分子量等信息。并將組間表達(dá)量相差2倍以上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)設(shè)定為差異表達(dá)蛋白質(zhì),由軟件自動生成分析結(jié)果,再結(jié)合人工驗(yàn)證。4、差異表達(dá)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)庫確認(rèn)用結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(matrix assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry, MALDI-OF-MS)對差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行肽質(zhì)量指紋(peptide mass fingerprint, PMF)檢測。根據(jù)http://www.uniprot.org/上的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索最終確定結(jié)果蛋白質(zhì)。5、用WB、IHC和酶聯(lián)免疫吸附檢測(enzyme-linked immunoabsorbent assay, ELISA)等方法檢測海馬中β-arrestin2和CRHR蛋白表達(dá)及相關(guān)激素的變化情況。6、用WB和RT-PCR法檢測海馬中β-arrestin 2 介導(dǎo)的 PP2A-Akt-mTOR信號通路的表達(dá)情況。7、用WB和IHC法檢測海馬中β-arrestin2介導(dǎo)的ERK-BDNF信號通路的表達(dá)情況。8、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)的形式表示,SPSS 13.0軟件統(tǒng)計(jì)包用于數(shù)據(jù)處理。大鼠每周的體重情況采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析,其余的指標(biāo),多樣本的均數(shù)比較均采用單因素方差分析,若方差齊,多重比較采用LSD法檢驗(yàn),若方差不齊,則采用Welch分析,多重比較采用Games-Howell法檢驗(yàn)。同組動物造模前后的均數(shù)比較采用配對樣本的t檢驗(yàn)。所有的檢驗(yàn)方法均以P0.05作為具有顯著性差異。結(jié)果：1、采用CUMS聯(lián)合孤養(yǎng)的方法成功復(fù)制了肝郁證大鼠模型。造模3周后,從一般狀態(tài)來看,造模初期,模型組大鼠表現(xiàn)為焦慮、煩躁、掙扎,隨后逐漸麻木,出現(xiàn)行動遲緩、躲在角落、食欲減退、皮毛無光澤、便溏等肝郁證表現(xiàn)。逍遙散組和氟西汀組上述表現(xiàn)較輕,且各種癥狀的發(fā)展變化相對緩慢。對照組則一直活潑好動,未見異常行為狀態(tài)。各組間體重增長具有顯著性差異,模型組體重最低,逍遙散組和氟西汀組體重則高于模型組,而對照組大鼠體重則一直處于穩(wěn)步增長中,體重最高。曠場實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的直立數(shù)和爬格數(shù)均顯著低于對照組,逍遙散組對其直立數(shù)和爬格數(shù)均有提高,氟西汀組則僅對爬格數(shù)有所提高。糖水消耗實(shí)驗(yàn)提示各組大鼠糖水消耗率具有顯著性差異,模型組的糖水消耗率低于其他組。食物消耗實(shí)驗(yàn)提示,模型組和兩藥物組食物消耗量均顯著低于對照組,但逍遙散組食物消耗量高于模型組,而氟西汀組則與模型組無顯著性差異。2、HE染色發(fā)現(xiàn)模型組神經(jīng)元縮小,細(xì)胞形態(tài)改變?yōu)椴灰?guī)則形,逍遙散組和氟西汀組神經(jīng)元改變則較模型組改善,尼氏染色發(fā)現(xiàn)模型組尼氏體數(shù)量減少,而逍遙散組和氟西汀組的尼氏體數(shù)量則較模型組增加。3、獲得了高質(zhì)量的海馬組織磷酸化蛋白質(zhì)的2-DE圖像,發(fā)現(xiàn)了10個肝郁證大鼠的差異蛋白,其中2個在模型組表達(dá)下調(diào),8個表達(dá)上調(diào),并鑒定出了蛋白的相關(guān)信息。4、β-arrestin 2和CRHR蛋白表達(dá)及相關(guān)激素的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：模型大鼠海馬的P-arrestin2蛋白表達(dá)較對照組下降,CRHR2蛋白表達(dá)則上調(diào),而逍遙散和氟西汀使其表達(dá)水平得到恢復(fù)。CRHR1蛋白表達(dá)則無顯著性差異。血清激素檢測,ACTH和CRH的濃度在各組大鼠間無顯著性差異,而模型組大鼠的CORT和Urocortin-2的濃度高于對照組,具有顯著性差異,而逍遙散組和氟西汀組CORT和Urocortin-2濃度則較模型組降低。腦脊液激素檢測,CRH濃度在各組大鼠間無顯著性差異,模型組Urocortin-2濃度高于對照組,具有顯著性差異。5、β-arrestin2介導(dǎo)的PP2A-Akt-mTOR信號通路研究發(fā)現(xiàn)：各組大鼠PP2A c、mTPR、Akt蛋白的表達(dá)無顯著性差異,而PP2A b、p-mTOR和p-Akt蛋白的表達(dá)則具有顯著性差異。其中PP2A b蛋白在模型組表達(dá)水平較對照組升高,而逍遙散組和氟西汀組的表達(dá)水平較模型組降低,p-mTOR和p-Akt蛋白在模型組表達(dá)水平較對照組降低,而逍遙散組和氟西汀組的表達(dá)水平較模型組升高。PP2Ac mRNA表達(dá)在各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,PP2A b mRNA的表達(dá)結(jié)果同PP2Ab蛋白表達(dá)情況。6、β-arrestin2介導(dǎo)的ERK-BDNF信號通路研究發(fā)現(xiàn)：各組大鼠ERK蛋白的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而p-ERK、BDNF 和 TrkB蛋白的表達(dá)則具有顯著性差異。這三個蛋白在模型組表達(dá)水平均較對照組降低,而逍遙散組和氟西汀組的表達(dá)水平較模型組升高。結(jié)論：通過對CUMS聯(lián)合孤養(yǎng)復(fù)制的肝郁證大鼠模型海馬組織磷酸化蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)了10個肝郁證大鼠的差異蛋白并鑒定出了蛋白的相關(guān)信息。并根據(jù)差異蛋白分析結(jié)果引出了肝郁證的關(guān)鍵信號分子β-arrestin 2,并研究了CRHR表達(dá)與相關(guān)激素的變化情況,以及其介導(dǎo)的PP2A-Akt-mTOR和ERK-BDNF信號通路。結(jié)果提示β-arrestin 2通過對CRHR2表達(dá)及Urocortin-2、 CORT濃度的影響,及介導(dǎo)PP2A-Akt-mTOR、ERK-BDNF信號通路改變引起大鼠海馬突觸可塑性的改變,導(dǎo)致肝郁證。而逍遙散可以通過調(diào)控海馬β-arrestin2介導(dǎo)的信號通路來改善肝郁證。本研究以前期蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果作為切入點(diǎn),提出β-arrestin 2是介導(dǎo)PP2A-Akt-mTOR, ERK-BDNF信號通路、調(diào)控肝郁海馬可塑性的關(guān)鍵分子,是肝郁證形成的新靶標(biāo),具有原始創(chuàng)新。
【關(guān)鍵詞】：肝郁證 PP2A β-arrestin 2 Akt mTOR BDNF
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R285
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 第一章 理論研究19-37
• 第一節(jié) 肝郁證及其研究現(xiàn)狀19-30
• 1、肝郁證的源流19-21
• 2、肝郁證的病因病機(jī)21-22
• 3、肝郁證的動物模型研究22-24
• 4、肝郁證的研究進(jìn)展24-29
• 5、肝郁證的治療29-30
• 第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)和中醫(yī)證候研究30-33
• 1、蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)30-31
• 2、蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于中醫(yī)證候研究的展望31-33
• 第三節(jié) 海馬及β-arrestin 2介導(dǎo)的信號通路與肝郁證的相關(guān)性探討33-37
• 1、肝郁證中存在海馬突觸可塑性障礙33-34
• 2、β-arrestin 2是介導(dǎo)海馬突觸可塑性的關(guān)鍵信號分子34-37
• 第二章 實(shí)驗(yàn)研究37-83
• 第一節(jié) 肝郁證動物模型的復(fù)制37-50
• 1、材料37-38
• 2、方法38-41
• 3、結(jié)果41-46
• 4、討論46-50
• 第二節(jié) 肝郁證大鼠海馬組織差異蛋白點(diǎn)分析50-60
• 1、海馬組織的形態(tài)學(xué)觀察50-53
• 2、海馬組織蛋白質(zhì)組2-DE分離圖像的制備和分析53-57
• 3、海馬組織差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)庫確認(rèn)57-58
• 4、討論58-60
• 第三節(jié) β-arrestin 2介導(dǎo)的信號通路在肝郁證中的調(diào)控機(jī)制研究60-83
• 1、β-arrestin 2與CRH受體及血清和腦脊液中相關(guān)激素變化的相關(guān)性60-70
• 2、β-arrestin 2介導(dǎo)的PP2A-Akt-mTOR信號通路研究70-77
• 3、β-arrestin 2介導(dǎo)的ERK-BDNF信號通路研究77-80
• 4、討論80-83
• 全文小結(jié)83-85
• 參考文獻(xiàn)85-100
• 縮略詞對照表100-101
• 論文發(fā)表情況101-102
• 致謝102-104
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)證明104

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本文編號：956661