本文關(guān)鍵詞：登革病毒全基因序列的時空特點和登革熱以及重癥登革的病原學(xué)診斷、臨床特點和預(yù)后預(yù)測分析

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【摘要】：登革熱(Dengue fever, DF)是由登革病毒(Dengue virus, DENV)感染引起的一種急性的媒介傳染病,該病毒感染宿主后其臨床表現(xiàn)各異,可以表現(xiàn)為無癥狀、輕型的流感樣綜合征,也可以表現(xiàn)為重癥登革熱(Severe dengue disease,SD),即登革出血熱(Dengue hemorrhagic fever, DHF)和登革休克綜合癥(Dengue shock symptom、DSS)。登革病毒是有包膜的單股正鏈RNA病毒,由11000個核苷酸組成。其基因組編碼成一個多肽鏈后,在宿主的信號肽酶及病毒編碼的蛋白酶作用下,裂解成三種結(jié)構(gòu)蛋白(衣殼蛋白C、膜蛋白及其前體M/prM和包膜蛋白E)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。 DENV分為4種血清型：DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4。該病主要通過埃及伊蚊和白紋伊蚊傳播,流行于熱帶及亞熱帶地區(qū),尤其是在亞洲、太平洋群島及中、南美洲國家已構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。據(jù)估計2010年感染登革病毒的人群約有3.9億,其中顯性感染為0.96億,隱性感染達(dá)到2.94億。目前,尚無有效的抗病毒藥物和疫苗用于臨床。同時伴隨著世界社會和經(jīng)濟效益的影響,登革熱傳播地理范圍逐漸增廣、感染人數(shù)逐漸增加和疾病的負(fù)擔(dān)逐漸加重,因此其已經(jīng)成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一。我國大陸自1978年廣東省佛山市首次暴發(fā)登革熱疫情以來,登革熱在我國已經(jīng)流行了37年。已經(jīng)報道流行的地區(qū)有海南、廣西、福建、浙江和云南省,2013年河南省也報道了登革熱的暴發(fā)。2014年廣東省暴發(fā)了自1986年以來最大的一次登革熱疫情,共有44894例患者,死亡6例。四種血清型的登革熱病毒在我國大陸都有流行過。1979年和1985年廣東省流行的登革病毒為DENV-1,而且1991年和1995年至2014年登革熱的流行和散發(fā)也是由DENV-1感染導(dǎo)致的；1985年海南省、1988年的廣西省、1993年、1998年和2001年廣東省、1999年福建省暴發(fā)的登革熱是由DENV-2感染導(dǎo)致；1982年以來我國大陸就很少有DENV-3的流行,而DENV-4為散發(fā)病例,常伴隨其他登革病毒的血清型共同流行。目前,最廣為接受的登革熱的基因分型使用的基因區(qū)域是E基因區(qū)域。雖然登革熱在我國國大陸流行以來,有研究使用登革病毒E基因區(qū)域分析其分子和進(jìn)化的特征,但是尚無研究評估登革病毒的各個基因區(qū)域是否適合用于登革病毒的分子流行病學(xué)特征的分析。所以需要分析我國大陸流行的登革病毒的分子流行病學(xué)特征,即評估登革病毒各個基因區(qū)域能否準(zhǔn)確反應(yīng)登革病毒全基因的特征和登革病毒的時空特點。感染登革病毒后,疾病譜較為寬廣,可以是無癥狀,或是重癥,甚至可能威脅生命。世界衛(wèi)生組織登革熱指南中確診登革病毒感染的方法有：登革病毒的分離和鑒定、病毒核酸檢測和血清中抗體檢測(IgM/IgG)檢測。但是這些方法都存在局限性,例如需要急性期患者的血清(感染登革病毒0-5天)、病毒的分離和確定需要較長時間(1周)、檢測結(jié)果的假陽性和假陰性,以及血清學(xué)檢測需要恢復(fù)期患者的血清進(jìn)一步確診。所以需要一種經(jīng)濟費用較低、省時和方便的實驗室檢測方法來確診登革病毒的感染。自從使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測到登革病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白1(NS1)后,學(xué)者們發(fā)現(xiàn)NS1蛋白有兩個存在形式：膜性和可溶性,并且都是非常保守的。據(jù)報道無論是首次感染還是二次感染登革病毒,登革熱患者在發(fā)病的急性期(O到6天)就能夠檢測到血清中的NSl蛋白,并且登革熱發(fā)病后9-18天,仍能在患者的外周血中檢測到。這為確診登革熱提供了較為廣泛的時間窗口。目前主要有兩種技術(shù)手段檢測登革病毒的NSl蛋白：一種是酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent assay, ELISA),另外一種是免疫層析法(Immunochromatography assay, IA)。根據(jù)這兩種技術(shù)原理,也開發(fā)出了相應(yīng)的捕獲登革病毒NS1蛋白商用試劑盒。在大多數(shù)的臨床研究中,也表明這兩種方法診斷登革熱的敏感性和特異性較好,所以需要與傳統(tǒng)實驗室檢測方法(登革病毒的分離和鑒定、病毒核酸檢測和血清中抗體檢測(IgM/IgG)檢測)相比,系統(tǒng)性的評價這兩種技術(shù)在確診登革熱中的作用。2009年世界衛(wèi)生組織(WHO)將登革熱分類為登革熱和重癥登革熱,包括了一系列的“預(yù)警指征”旨在幫助臨床醫(yī)生預(yù)測有可能進(jìn)展為重癥登革熱的患者。因為登革熱患者預(yù)警指征幫助臨床醫(yī)生早期識別患者的疾病轉(zhuǎn)歸,并決定患者的管理和治療。早期出現(xiàn)登革熱輕型臨床表現(xiàn)的患者可以通過傳統(tǒng)的實驗室檢測病毒或特異性的抗體來確診登革熱病毒的感染,但是對于重癥登革熱患者難以確診,因為其臨床表現(xiàn)相對出現(xiàn)在疾病的晚期,常常是患者血液中已經(jīng)檢測不到病毒和特異性的抗體,也缺乏其他特異性的實驗室檢測指標(biāo)。然而,由于有較好的臨床支持治療和護(hù)理,重癥登革熱的死亡率是可以不超過1%。因此,很多學(xué)者的研究集中到能確定患者疾病進(jìn)展的高風(fēng)險因素。WHO的指南將非重癥登革熱分為兩類：一類是登革熱伴有腹痛、粘膜出血和肝腫大等預(yù)警指征,另外一類是不伴有預(yù)警指征的登革熱,而登革熱伴有預(yù)警指征的患者提示需要重癥監(jiān)護(hù)、疾病更嚴(yán)重,甚至是與死亡相關(guān),所以臨床表現(xiàn)仍是早期預(yù)測的指標(biāo)。雖然有報道登革熱的其他的臨床癥狀,如惡心、嘔吐、腹痛、皮疹和出血等臨床癥狀也與重癥登革熱有關(guān),但是這些關(guān)系仍未闡明。臨床上登革熱患者出血的癥狀表現(xiàn)各異,例如皮膚瘀斑、束臂試驗、牙齦出血、胃腸道出血等。原先診斷登革出血熱的標(biāo)準(zhǔn)之一：束臂試驗,也有研究已經(jīng)表明不能區(qū)分登革熱和登革熱出血熱�；谝陨涎芯恐g存在著爭議,需要對既往研究進(jìn)行系統(tǒng)的評價,確定早期預(yù)測重癥登革熱的臨床癥狀和體征,以降低重癥登革熱的死亡率。血液學(xué)的參數(shù)也常常被認(rèn)為是潛在的預(yù)測因子,最常用的指標(biāo)是血小板計數(shù)。但是血小板減少癥與出血的相關(guān)性不佳,只有一項研究中證實低血小板計數(shù)與血管滲漏的嚴(yán)重程度相關(guān)。登革熱患者的肝臟損害也是常見癥狀之一,各種程度的感染都能導(dǎo)致轉(zhuǎn)氨酶的升高。患者的肝臟損害越嚴(yán)重,疾病的臨床表現(xiàn)就越嚴(yán)重。在疾病的極期,低蛋白血癥與血管滲漏也存在很好的相關(guān)性。最新一項系統(tǒng)性評價結(jié)果表明凝血酶原時間(PT)和活化部分凝血酶原時間(APTT)的延長與登革休克綜合征是顯著相關(guān)的。然而這些這些研究結(jié)果主要來自亞洲和拉丁美洲,缺少我國大陸的相關(guān)數(shù)據(jù)。2014年我國廣東省出現(xiàn)了自1978年以來暴發(fā)規(guī)模較大的一次流行,截止到2014年12月1日,共有共有44894例登革熱患者。所以需要研究我國登革熱患者的數(shù)據(jù),從臨床癥狀、體征和血液學(xué)參數(shù)分析重癥登革熱的預(yù)測因素。第一部分我國大陸登革病毒全基因的時空分析研究方法從NCBI的GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中下載我國大陸1978年至2011年登革病毒全長基因序列,并同時下載國際公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)株序列,即：登革病毒Ⅰ型夏威夷株(DENV-1, Hawaii株)、登革病毒Ⅱ型新幾內(nèi)亞株(DENV-2, New guinea-C株)、登革病毒Ⅲ型H87株(DENV-3, H-87株)和登革病毒Ⅳ型H241株(DENV-4, H241株)。將DENV-1和DENV-2病毒的基因序列裝載到Mega5.05軟件中進(jìn)行多序列比對,比對完成后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹和基因的遺傳進(jìn)化距離。對四種血清型的氨基酸變異分析,使用統(tǒng)計軟件SPSS13.0軟件。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)。對于符合參數(shù)檢驗的多組之間采用One-Way ANOVA(檢驗統(tǒng)計量：F),兩組間采用Student-t Test(檢驗統(tǒng)計量：t)；對于不符合參數(shù)檢驗的多組之間采用非參數(shù)檢驗：Kruskal-Wallis檢驗(檢驗統(tǒng)計量：x2)、Mann-Whitney U檢驗(檢驗統(tǒng)計量：Z),取雙側(cè)P0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。研究結(jié)果1.共納入分析登革病毒40株,其中DENV-1為19株,DENV-2為11株,DENV-3為6株,DENV-4為4株。DENV-1和DENV-2的14個基因區(qū)域與全基因構(gòu)建的進(jìn)化樹不完全相似,并且各個基因的遺傳進(jìn)化距離變異較大。2.根據(jù)登革病毒的四種血清型分為四組：DENV-1氨基酸突變個數(shù)為85.211±13.252個；DENV-2為72.727±21.448個；DENV-3為59.167±22.649個；DENV-4為82±18.129個。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示四種血清型的登革病毒之間的氨基酸變異個數(shù)具有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(F=5.661,p=0.003),進(jìn)一步的多重比較選LSD法,DENV-1與DENV-2和DENV-3氨基酸變異數(shù)存在顯著性差異(p=0.002和p=0.003),其余組之間無顯著性差異,說明DENV-1的氨基酸變異個數(shù)最多。3.根據(jù)登革病毒的分離時間和血清型分為四組：1991年至2000年的DENV-1,共5株,開放閱讀框的氨基酸變異個數(shù)82±6.7個；2001年至2010年的DENV-1,共12株,氨基酸變異個數(shù)為89.2±14.2個；1991年至2000年的DENV-2,共4株,氨基酸變異個數(shù)為74.8±7.8個；2001年至2010年的DENV-2,共4株,氨基酸變異個數(shù)為70.0±5.7個。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示四組之間的氨基酸變異個數(shù)具有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(F=3.671,p=0.029)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)以2000年以后流行的DENV-1和DENV-2病毒株的E基因區(qū)域(非參數(shù)檢驗：Mann-Whitney U法)和NSl基因區(qū)域(參數(shù)檢驗：Students-t法)的氨基酸變異個數(shù)存在顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(E基因區(qū)域：Z=2.961,p=0.003; NS1基因區(qū)域：t=4.896,p0.001)。4.進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)在DENV-1病毒株的E基因區(qū)域出現(xiàn)N290D, L402F和A473T的突變,在NS1區(qū)域中出現(xiàn)R101K、G105R、D340E和L349M的突變,而這些突變位點在DENV-2病毒株中未出現(xiàn)。5.根據(jù)登革病毒流行的地點分為兩組：流行于廣州地區(qū)的DENV-1共14株,NS3的氨基酸變異個數(shù)為12.1±2.0個；非廣州地區(qū)的DENV-1共5株,NS3基因區(qū)域的氨基酸變異個數(shù)為9.8±1.8個。流行于廣州地區(qū)的DENV-1病毒株,其NS3區(qū)氨基酸變異數(shù)高于非廣州地區(qū),差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性意義(t=2.3,p=0.034)；廣州地區(qū)的DENV-2共4株,NS3基因區(qū)域的氨基酸變異個數(shù)為12.8±1.5個,非廣州地區(qū)的DENV-2共7株,NS3基因區(qū)域的氨基酸變異個數(shù)為8.4±4.5個,流行于廣州地區(qū)的DENV-2病毒株,其NS3區(qū)的氨基酸變異數(shù)高于非廣州地區(qū),差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性意義(Z=2.2,p=0.042)第二部分NS1蛋白捕獲法診斷登革熱的系統(tǒng)評價研究方法制定文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn),需要實驗室確診為登革病毒感染,以下三種方法之一即病毒的分離和鑒定、病毒RNA檢測和IgM和/或IgG血清學(xué)轉(zhuǎn)換的血清學(xué)的檢測,同時報道有NS1檢測結(jié)果；納入研究的登革病毒感染人群和對照人群的樣本量,每組至少50例。檢索數(shù)據(jù)庫NCBI PubMed、ISI Web of Science、Google學(xué)術(shù)和中國學(xué)術(shù)期刊全文數(shù)據(jù)庫(the Chinese National Knowledge Infrastructure databases, CNKI),檢索的時間設(shè)定均從建庫到2012年10月。檢索詞以"dengue"、“NS1”或"non-structure 1"、"diagnosis"主題詞進(jìn)行布爾邏輯搭配檢索。提取數(shù)據(jù),評價納入研究的文獻(xiàn)質(zhì)量,并使用STATA 11.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。研究結(jié)果共納入18篇觀察性研究,12313患者。單用NS1檢測法,分為兩種,即酶聯(lián)免疫吸附法(Panbio Dengue Early ELISA Kit,Dengue NS1 Ag ELISA Kit和Platelia Dengue NS1 Ag-ELISA Kit)和免疫層析法(Dengue NS1 Ag STRIP Kit和SDBIOLINE Dengue Duo Strip Kit),其合并后的敏感性為67%(95%CI為59-74%)和99%(95%CI為97-99%),特異性為71%(95% CI為61-79%)和99%(95%CI為98-100%),診斷風(fēng)險比(DOR)為148(95% CI為51-429)和328(95% CI為103-1046),以及受試者工作曲線下面積(HSROCs)為0.92和0.96。對于NS1聯(lián)合IgM檢測,合并后的敏感性、特異性、DOR和HSROC分別為83%(95% CI68-92%)、86%(95% CI 79-91%)、31(14-70)和0.91(95% CI0.89-0.93)。登革熱病毒血清分型：DENV-1為50%-90.9%之間,DENV-2為38.5-85.7%,DENV-3為46.7-91.3%和DENV-4為21.7-87%。第三部分臨床癥狀和體征預(yù)測重癥登革熱的系統(tǒng)評價研究方法制定文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn),符合登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn),不限納入研究的類型,可以是觀察性研究,明確將患者分為登革熱和重癥登革熱(登革出血熱或登革休克綜合征),并能分別獲得各組患者臨床癥狀和體征的信息。排除重復(fù)使用的樣本的研究和信息不足的研究。檢索數(shù)據(jù)庫NCBI PubMed、Armed Forces Pest Management Board Literature Retrieval System和Googl學(xué)術(shù)。檢索的時間設(shè)定均從建庫到2000年1月至2012年8月。檢索詞以"dengue fever"、"DF"、"dengue haemorrhagic fever"、"DHF"、"dengue shock syndrome"、"DSS"和"clinical"主題詞進(jìn)行布爾邏輯搭配檢索。提取數(shù)據(jù),評價納入研究的文獻(xiàn)質(zhì)量,并使用STATA11.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。研究結(jié)果16篇研究納入分析,共納入分析11個因素,分別為：性別、惡心/嘔吐、出血(牙齦出血、鼻出血、嘔血和黑便)、頭痛、腹痛、眶后痛、皮疹、腹瀉、肝腫大、乏力和束臂試驗。其中5個因素是增加重癥登革熱發(fā)生的危險因素,即出血(OR:13.617,95% CI:3.281-56.508)、惡心/嘔吐(OR:1.692,95% CI1.256-2.280)、腹痛(OR:2.278,95% CI:1.631-3.182)、皮疹(OR:2.031, 95% CI:1.269-3.250)和肝腫大(OR:4.751,95% CI:1.769-12.570)。在出血的四種相關(guān)的癥狀重,只有嘔血(OR:6.174,95% CI:2.66-14.334, P 0.001)和黑便(OR:10.351,95% CI:3.065-34.956, P 0.001)可顯著增加重癥登革熱的發(fā)生,其余則不增加重癥登革的發(fā)生,而頭痛(OR:0.555,95% CI: 0.455-0.676)則可以減少重癥登革熱發(fā)生。第四部分2014年廣東省212例登革熱的臨床特征分析研究方法納入2014年6月至10月在南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院和廣州市第八人民醫(yī)院住院的登革熱患者回顧性分析,入選標(biāo)準(zhǔn)患者符合2009年WHO發(fā)布的登革熱診療指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)。采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,對于符合參數(shù)檢驗的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示,組間比較采用t檢驗(Student's t test);不符合參數(shù)檢驗的計量資料采用中位數(shù)和極大值、極小值表示,組間比較采用非參數(shù)檢驗(Kruskal-Wallis test)。采用MedCalc軟件繪制受試者工作特征曲線(ReceiverOperating Characteristic Curve,ROC曲線),并統(tǒng)計ROC曲線下面積(Area Under the ROC, AUC),以及臨界值。二分類的Logistic回歸用于分析預(yù)測重癥登革熱的因素。P值取雙側(cè),且P0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。研究結(jié)果共納入212例住院患者,平均年齡為40.6±16.0歲,男性102例,女性110例,登革熱組患者為174例,重癥登革熱組患者38例。兩組患者在性別上存在顯著性差異(p=0.003),重癥登革熱患者女性較多。兩組患者的臨床表現(xiàn)中,重癥登革熱患者中出現(xiàn)意識障礙、嗜睡、黃疸、胸腔積液、腹水、HCT升高超過20%伴血小板快速降低和陰道出血顯著高于登革熱患者(p均小于0.05)。血液學(xué)參數(shù)結(jié)果提示重癥登革熱患者的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、草氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、白細(xì)胞計數(shù)(WBC)、活化部分凝血酶原時間(APTT)和凝血酶原時間(PT)顯著性高于登革熱患者(p均小于0.05),而白蛋白(ALB)和PLT計數(shù)(PLT)則均顯著性低于登革熱患者。AST和ALB對診斷重癥登革熱的價值較低(ROC曲線下面積在0.5-0.7之間),ALT.WBC和APTT診斷重癥登革熱的價值也較低(雖然ROC曲線下面積在0.7-0.9之間,但是95%置信區(qū)間包含有0.5),PLT和PT對重癥登革熱的診斷,其準(zhǔn)確性中等。結(jié)論1.對我國大陸流行的DENV-1和DENV-2,分析登革病毒在選擇壓力下的演化和變異,DENV-1的全長基因序列、DENV-2的全長基因和開放閱讀框的基因序列是合適的目的基因,而E基因區(qū)域可能不合適。2000年以后主要為DENV-1的流行,E基因和NS1基因區(qū)域的氨基酸突變可能是原因之一；而不同區(qū)域的DENV-1和DENV-2的流行程度可能與NS3基因區(qū)域的氨基酸突變有關(guān)。2.單用NS1檢測法可以用來確診登革病毒的感染,NS1聯(lián)合IgM檢測法可以用來監(jiān)測登革熱。NS1檢測法可以鑒別出DENV-1和DENV-3。此外,商用Dengue NS1 Ag STRIP試劑是診斷和病毒血清分型的最佳試劑。3.登革熱患者存在惡心/嘔吐、持續(xù)腹痛、皮疹、明顯出血傾向和肝腫大的登革熱患者更易進(jìn)展為重癥登革熱,而頭痛的患者進(jìn)展為重癥登革熱的概率較低。其他因素,如疲乏、眶后痛、腹瀉和束臂試驗不能預(yù)測重癥登革熱。4.我國大陸登革熱患者中,女性更易進(jìn)展為重癥登革熱。與重癥登革熱相關(guān)的臨床特點和血液學(xué)參數(shù)為：意識障礙、嗜睡、黃疸、胸腔積液、腹水、陰道出血、ALT、AST、ALB、WBC、PLT、APTT和PT。二分類的Logictic回歸分析結(jié)果顯示,性別和血液學(xué)參數(shù)(WBC、PLT和PT)是可以用來預(yù)測重癥登革熱。
【關(guān)鍵詞】：登革病毒 登革熱 基因 時空特點 預(yù)測 臨床特點
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R512.8
【目錄】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-24
• 前言24-31
• 第一章 我國大陸登革病毒全基因的時空分析31-51
• 1 材料31-32
• 2 方法32-34
• 3 結(jié)果34-48
• 4 討論48-51
• 第二章 NS1蛋白捕獲法診斷登革熱的系統(tǒng)評價51-72
• 1 資料與方法51-53
• 2 結(jié)果53-69
• 3 討論69-72
• 第三章 臨床癥狀和體征預(yù)測重癥登革熱的系統(tǒng)評價72-85
• 1 材料與方法72-74
• 2 結(jié)果74-82
• 3 討論82-85
• 第四章 2014年廣東省212例登革熱的臨床特征分析85-95
• 1 研究對象與方法85-86
• 2 結(jié)果86-92
• 3 討論92-95
• 全文總結(jié)95-96
• 參考文獻(xiàn)96-110
• 縮略語詞匯表110-112
• 博士期間論文發(fā)表情況112-114
• 致謝114-116

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本文編號：937373