本文關(guān)鍵詞：耐比卡魯胺R3327前列腺癌細(xì)胞系雄激素抵抗的研究

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【摘要】：研究背景：在北歐和美國(guó),前列腺癌目前已經(jīng)成為成年男性中最高發(fā)的惡性腫瘤,并且在多數(shù)西方國(guó)家中,導(dǎo)致男性癌癥患者死亡的惡性腫瘤排行榜中前列腺癌高居第二位,僅次于肺癌,僅僅在2013年美國(guó)就有超過29,000名男性患者死于前列腺癌。在我國(guó)前列腺癌患者發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢(shì)。而隨著科技的不斷進(jìn)步,篩查和診斷水平相應(yīng)快速提高,85%的早期前列腺癌患者都可以及早發(fā)現(xiàn),這部分患者是幸運(yùn)的。該期病人接受放療或者根治性手術(shù)治療以后,在理論上是可以達(dá)到完全治愈的效果。與之相反的是,很多患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)不屬于早期前列腺癌,這部分進(jìn)展期前列腺癌患者失去手術(shù)或者放療的機(jī)會(huì),轉(zhuǎn)而進(jìn)行內(nèi)分泌治療。目前內(nèi)分泌治療的主要方法是應(yīng)用雄激素受體拮抗類藥物,如比卡魯胺、氟他胺等,初發(fā)的前列腺癌多是對(duì)內(nèi)分泌治療敏感,但經(jīng)過一段時(shí)間治療后,這部分激素依賴性前列腺癌多數(shù)要轉(zhuǎn)化為激素非依賴性前列腺癌(CRPC),一旦轉(zhuǎn)變成為后者則患者預(yù)后極差,中位生存時(shí)間平均僅有16到18個(gè)月。對(duì)于CRPC患者的研究從來沒有停止,但目前對(duì)這部分患者的中位生存時(shí)間改善并不明顯。CRPC的形成機(jī)制目前仍不清楚,是前列腺癌研究方面的一個(gè)熱點(diǎn)。線粒體在其中發(fā)揮的作用逐漸引起重視。線粒體本身包含自己的基因組,并且是生命生存所需要的最基本的、同時(shí)也是相對(duì)比較復(fù)雜的細(xì)胞器。人體內(nèi)最基本生化反應(yīng)如：能量產(chǎn)生、凋亡、氨基酸和脂類的合成都在線粒體內(nèi)發(fā)生,因此,科學(xué)家們有理由懷疑線粒體的新陳代謝功能障礙或者功能失調(diào)可以導(dǎo)致腫瘤對(duì)藥物治療的反應(yīng)下降,并且增加腫瘤的惡性程度和侵襲性。在前列腺癌方面現(xiàn)有研究證明,線粒體DNA (mtDNA)的突變,包括：點(diǎn)突變、多段缺失和DNA耗盡都可以加速腫瘤發(fā)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。特別是近年來有研究發(fā)現(xiàn),mtDNA的突變可以導(dǎo)致激素依賴性前列腺癌轉(zhuǎn)變成為激素非依賴性前列腺癌,而體外研究也進(jìn)一步證實(shí),細(xì)胞內(nèi)每減少10-100個(gè)mtDNA的拷貝就可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧耗量下降,整個(gè)細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境由乏氧狀態(tài)變?yōu)楦哐鯛顟B(tài),進(jìn)一步激活甲羥戊酸途徑和原癌基因Ras,繼發(fā)激活ERK, AKT,NF-Kb和JNK途徑,使正常增殖的細(xì)胞發(fā)生突變,轉(zhuǎn)而表現(xiàn)出惡性表型。研究目的：本試驗(yàn)研究中,我們用治療量濃度的雄激素受體拮抗劑R-比卡魯胺長(zhǎng)期體外培養(yǎng)前列腺癌雄激素敏感性細(xì)胞系R3327-H,通過多次傳代,最終成功誘導(dǎo)建立了R3327-H的亞系-耐R-比魯胺的R3327細(xì)胞亞系(R3327-Rb ic)并檢測(cè)R3327-Rbic的細(xì)胞形態(tài)、侵襲性。將R-比卡魯胺與R3327-H和R3327-Rbic細(xì)胞進(jìn)行共同培養(yǎng)后,運(yùn)用基因芯片技術(shù),研究了在此過程中雄激素受體(AR)、線粒體DNA (mtDNA)基因突變的情況,比較了兩種細(xì)胞增殖過程中AR以及線粒體調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白Drp-1表達(dá)的變化情況,并應(yīng)用realtime RT-PCR技術(shù),weston-blot技術(shù)驗(yàn)證基因測(cè)序所得出的結(jié)果,部分闡明了R3327-H前列腺癌細(xì)胞由激素敏感性轉(zhuǎn)變成為激素抵抗性過程中mtDNA、AR的突變情況,明確了這一過程中氧化呼吸鏈相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)建立了R-比卡魯胺耐受性前列腺癌細(xì)胞系R3327-Rbic及R-比卡魯胺耐受細(xì)胞系的動(dòng)物模型,進(jìn)一步來研究了雄激素敏感性細(xì)胞系R3327-H在R-比卡魯胺的作用下產(chǎn)生藥物耐受性的機(jī)理,從而為今后的對(duì)于CRPC的研究奠定了理論基礎(chǔ),為CRPC的患者的進(jìn)一步治療提供細(xì)胞系和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),為CRPC的治療提供便利條件。研究方法：1、R-比卡魯胺對(duì)前列腺癌細(xì)胞R3327-H和R3327-Rbic的作用及R3327-Rbic細(xì)胞的特性：1)應(yīng)用電子顯微鏡觀察R-比卡魯胺作用于R3327-H后形成的R3327-Rbic細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面發(fā)生的變化。2)R-比卡魯胺在兩種細(xì)胞中濃度不斷增加,達(dá)到20μmol/l治療濃度后應(yīng)用噻唑藍(lán)(MTT)法研究R-比卡魯胺對(duì)R3327-H和R3327-Rbic兩種細(xì)胞系的抑制作用,并根據(jù)觀察結(jié)構(gòu)繪制細(xì)胞隨藥物濃度變化而生成的抑制率曲線。3)應(yīng)用流式細(xì)胞儀研究在R-比卡魯胺作用下R3327-H和R3327-Rbic兩種細(xì)胞系所處細(xì)胞周期情況。4)應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)R-比卡魯胺對(duì)R3377-H和R3327-Rhic兩種細(xì)胞系腫瘤細(xì)胞侵襲能力的影響。2、R3327-Rbic細(xì)胞對(duì)R-比卡魯胺耐受的機(jī)理研究1)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(q-PCR技術(shù))檢測(cè)R-比卡魯胺作用后R3327-Rbic細(xì)胞系內(nèi)線粒體的兩種重要功能區(qū)D-Loop和C02的mtDNA含量的變化。2)應(yīng)用realtime RT-PCR技術(shù)研究雄激素受體(AR)及線粒體呼吸鏈相關(guān)12s,16s核糖體RNA、MT-ND2、MT-ND4和MT-ND6、細(xì)胞色素B、ATP6等多肽的mRNA的表達(dá)情況。3)應(yīng)用Illumina Seauencing程序完成對(duì)R3327鼠的基因測(cè)序,獲得的數(shù)據(jù)加入基因庫(kù),對(duì)R3327-Rbic細(xì)胞進(jìn)行基因測(cè)序,比較基因突變情況。4)weston-blot技術(shù)檢測(cè)R-比卡魯胺作用于兩種細(xì)胞增殖整個(gè)過程中AR及Drp-1蛋白表達(dá)情況,以驗(yàn)證基因測(cè)序所得出的結(jié)果。3、R-比卡魯胺耐受的鼠前列腺癌R3327-Rbic模型建立的研究1)應(yīng)用Martigel等輔助手段在哥本哈根鼠(R3327鼠)體內(nèi)建立細(xì)胞的體內(nèi)R3327-H和R3327-Rbic兩種細(xì)胞的成瘤動(dòng)物模型。2)應(yīng)用已經(jīng)成瘤的動(dòng)物模型分為R3327-H、R3327-Rbic、R3327-H\Rbic、 R3327-Rbic\Rbic四組,來研究R-比卡魯胺耐受性和非耐受性細(xì)胞模型在R-比卡魯胺作用下腫瘤體積大小3)獲得成瘤動(dòng)物模型瘤體,用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL)比較兩種細(xì)胞體內(nèi)凋亡水平的表達(dá)差異。研究結(jié)果：1、R-比卡魯胺對(duì)前列腺癌細(xì)胞R3327-H和R3327-Rbic的作用及R3327-Rbic細(xì)胞的特性：1)R-比卡魯胺作用于R3327-H細(xì)胞5天后細(xì)胞生長(zhǎng)就被明顯抑制。這種情況持續(xù)了24個(gè)周,24個(gè)周后細(xì)胞又開始復(fù)制�？梢苑蛛x出新的細(xì)胞,叫做R3327-Rbic細(xì)胞,這種細(xì)胞生長(zhǎng)速度更快,與R3327-H相比,倍增時(shí)間由50小時(shí)縮減到25小時(shí)。兩種細(xì)胞都具有典型細(xì)胞形態(tài),有特征性的核,清晰可見的核膜,有多個(gè)核仁的染色體結(jié)構(gòu)。高倍鏡下可以顯示后者線粒體形態(tài)發(fā)生細(xì)微的變化,包括管狀形態(tài)和線粒體嵴增大。2)MTT檢驗(yàn)用來分析增加R-比卡魯胺濃度對(duì)R3327-H及R3327-Rbic的影響。生存曲線顯示,R3327細(xì)胞在0.02 μ mol/l濃度的R-比卡魯胺溶液中生存率就表現(xiàn)出濃度依賴性的抑制,半數(shù)抑制濃度為0.7μmol/l。但是,R-比卡魯胺對(duì)R3327-Rbic細(xì)胞的生長(zhǎng)影響較小,僅僅在濃度達(dá)到20 μ mol/l的情況下曲線才有所下降。這說明治療劑量下的R-比卡魯胺對(duì)于R3327-Rbic的增殖已經(jīng)失去調(diào)控作用,細(xì)胞對(duì)藥物已經(jīng)不敏感。3)通過流式細(xì)胞儀測(cè)定兩種細(xì)胞周期顯示,與對(duì)照組相比,R3327-H細(xì)胞多處于G1期,比例達(dá)到61%,而R3327-Rbic細(xì)胞大多數(shù)處于S期,比例可達(dá)到28%,這表明R-比卡魯胺可抑制R3327-H組細(xì)胞增殖,將細(xì)胞周期限制在G1期,而對(duì)R3327-Rbic細(xì)胞則多數(shù)位于增殖活躍的S期,說明R3327-Rbic細(xì)胞對(duì)R-比卡魯胺的抑制作用已不再有反應(yīng)。4) Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)穿透膜的細(xì)胞數(shù)量,這種能力可以反映腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。通過對(duì)兩組細(xì)胞透膜細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在400倍高倍視野下,正常細(xì)胞穿膜數(shù)為(60.2±6.23)個(gè),R3327-H組細(xì)胞為(35.2±7.55)個(gè)(p0.05),R3327-Rbic組細(xì)胞為(56.2±4.73)個(gè)(p0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明雖然經(jīng)過R-比卡魯胺處理,但R3327-Rbic組細(xì)胞的體外侵襲能力未受明顯影響,而R3327-H組細(xì)胞穿膜能力大大下降,侵襲力明顯減弱。2、R3327-Rbic細(xì)胞對(duì)R-比卡魯胺耐受的機(jī)理研究1)用超螺旋敏感的qPCR方法來觀察R-比卡魯胺對(duì)兩組細(xì)胞mtDNA的含量以及mtDNA相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明兩種細(xì)胞和模板mtDNA中D-Loop和C02mtDNA的含量差別不大,均保持在較低水平,這表明R-比卡魯胺對(duì)于兩組細(xì)胞mtDNA的結(jié)構(gòu)影響微乎其微。但是,在預(yù)熱模板中檢測(cè)D-LOOP和C02基因的拷貝數(shù)量后可以發(fā)現(xiàn)R3327-Rbic組較R3327-H組明顯下降,這預(yù)示經(jīng)過R-比卡魯胺處理后的R3327-Rbic細(xì)胞總mtDNA數(shù)量是下降的。2)realtime RT-PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)呼吸鏈復(fù)合體的一系列基因進(jìn)行檢測(cè),可以很明確的發(fā)現(xiàn),R3327-Rbic細(xì)胞的這些基因的mRNA水平較R3327-H細(xì)胞下降的。其中12s基因表達(dá)下降最少,而ND6基因表達(dá)下降最多。R3327-Rbic細(xì)胞的AR基因表達(dá)相對(duì)R3327-H細(xì)胞是1.8,而R3327-H細(xì)胞在經(jīng)過R-比卡魯胺處理后Drp-1的表達(dá)明顯增加,超過了R3327-Rbic細(xì)胞中的表達(dá),而R-比卡魯胺對(duì)后者中Drp-1的表達(dá)幾乎沒有影響。3)Illu mina基因測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)R3327細(xì)胞的線粒體DNA和AR,并將R3327-Rbic細(xì)胞的線粒體DNA的基因組檢測(cè)結(jié)果與之比較,觀察基因突變情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)線粒體DNA中ATP6 T8993位點(diǎn)突變,AR中T877A位點(diǎn)突變。4)通過weston-blot方法檢測(cè)了兩種細(xì)胞中雄激素受體(AR)水平和Drp-1蛋白表達(dá)水平。R3327-Rbic組細(xì)胞中AR表達(dá)水平較R3327-H組細(xì)胞增加,但同時(shí)Drp-1水平卻較R3327-H組下降。3、R-比卡魯胺耐受的鼠前列腺癌R3327-Rbic模型建立的研究1)應(yīng)用兩種細(xì)胞系背側(cè)種植在哥本哈根鼠(R3327鼠)體內(nèi)建立細(xì)胞的體內(nèi)R3327-H和R3327-Rbic兩種細(xì)胞的成瘤動(dòng)物模型。R3327-H組接種成瘤比例80%(8/10只),R3327-Rbic組接種成瘤比例70%(7/10只)2)研究R-比卡魯胺耐受性和非耐受性細(xì)胞動(dòng)物模型自然進(jìn)程和在R-比卡魯胺作用下瘤體積大小。比較發(fā)現(xiàn),R3327-H組、R3327-Rbic組和R3327-Rbic\Rbic三組之間瘤體大小差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而R3327-H\Rbic組瘤體與前三組相比瘤體明顯偏小,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3)取出腫瘤標(biāo)本,用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL)比較兩種細(xì)胞體內(nèi)凋亡水平的表達(dá)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：熒光顯微鏡下觀察經(jīng)DAPI染色后各標(biāo)本細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。R3327-H組、R3327-Rbic組和R3327-Rbic\Rbic三組細(xì)胞凋亡陽(yáng)性率差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,R3327-H\Rbic組細(xì)胞凋亡陽(yáng)性率明顯高于其他三組。研究結(jié)論：1、R-比卡魯胺對(duì)前列腺癌細(xì)胞R3327-H和R3327-Rbic的體外作用及其相關(guān)機(jī)理研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)MTT檢驗(yàn)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)證明R-比卡魯胺對(duì)于R3327-Rbic的增殖已經(jīng)失去調(diào)控作用,細(xì)胞對(duì)該藥物已經(jīng)不敏感,Transwell實(shí)驗(yàn)證明R3327-Rbic的體外侵襲能力基本未受R-比卡魯胺作用影響。2、RT-PCR研究表明R-比卡魯胺對(duì)于兩組細(xì)胞mtDNA的結(jié)構(gòu)影響較小,但R3327-Rbic細(xì)胞總mtDNA數(shù)量是下降的。多種實(shí)驗(yàn)方法可以驗(yàn)證R3327-Rbic組細(xì)胞中AR表達(dá)水平較R3327-H組細(xì)胞增加,但同時(shí)R3327-H組經(jīng)比卡魯胺作用后Drp-1水平卻明顯上升,具體原因尚待進(jìn)一步的研究。線粒體DNA中ATP6T8993位點(diǎn)突變,AR中T877A位點(diǎn)突變。證明mtDNA和AR基因突變參與激素非依賴前列腺癌形成過程。3、R-比卡魯胺耐受的鼠前列腺癌R3327-Rbic模型建立的研究發(fā)現(xiàn),R3327-Rbic細(xì)胞可成功建立成瘤動(dòng)物模型,并且該模型繼續(xù)保持對(duì)R-比卡魯胺的耐受性,不受該類藥物的調(diào)控。
【關(guān)鍵詞】：前列腺癌 R-比卡魯胺 R3327細(xì)胞 線粒體DNA 雄激素受體
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.25
【目錄】：

• 中文摘要6-12
• 英文摘要12-20
• 縮略詞說明20-22
• 前言22-29
• 材料和方法29-45
• 結(jié)果45-49
• 討論49-60
• 小結(jié)60-61
• 附 圖61-72
• 附表72-76
• 綜述76-87
• 正文參考文獻(xiàn)87-101
• 致謝101-102
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄102-103
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況103-104
• 外文論文104-135

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 俞建軍;徐月敏;;前列腺組織mtDNA突變對(duì)前列腺癌惡性程度的影響[J];臨床泌尿外科雜志;2010年08期

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本文編號(hào)：887122