本文關鍵詞：人類弱精子癥精子的容積調節(jié)能力、運動能力和氯通道的表達

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【摘要】：目的:闡明調節(jié)精子功能的機制是診斷和治療男性不育、開發(fā)新型男性避孕手段的先決條件。容積調節(jié)能力對于精子的生理功能至關重要,容積敏感性氯通道是決定精子調節(jié)能力的關鍵因素之一,參與健康精子細胞在低滲環(huán)境中的容積調節(jié)過程。動物實驗表明,不育小鼠精子的容積調節(jié)能力明顯降低。然而人類弱精子的容積調節(jié)能力以及氯通道的表達情況尚不清楚。本研究旨在研究人類弱精子癥精子在低滲環(huán)境中的容積調節(jié)能力,以及氯通道在精子容積調節(jié)和運動中發(fā)揮的作用,并探討容積敏感性氯通道在弱精子的表達及其在運動中的作用,為臨床治療男性不育以及開發(fā)離子通道型男性避孕藥提供理論依據(jù)。方法:1)根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)出版的《人類精液檢驗與處理實驗室手冊(第五版)》中實驗方法,采用計算機輔助精液分析系統(tǒng)(CASA)進行精液常規(guī)分析;2)正常精子和弱精子精液樣本均由廣東省計劃生育�？漆t(yī)院男性實驗室和人類精子庫提供;3)用計算機輔助精液分析系統(tǒng)(CASA)檢測精子的各項運動參數(shù),如精子的前向運動(PR)百分比、直線運動速率(VSL)、曲線運動速率(VCL)、平均路徑速率(VAP);4)根據(jù)流式細胞術檢測到的前向散射信號來反映精子的容積變化;5)用激光共聚焦免疫熒光技術檢測氯通道在精子上的表達與定位,并用流式細胞術分析精子氯通道的相對表達量。結果:在等滲液(BWW330)中,正常精子細胞容積維持穩(wěn)定,改用低滲液(BWW290)孵育,正常人的精子容積幾乎沒有變化(P0.05),表明正常精子在低滲環(huán)境中能夠有效地調節(jié)自身的容積,恢復細胞的正常大小。然而弱精子在低滲液中的容積明顯變大(P0.01),表明在低滲環(huán)境下,弱精子不能有效地調節(jié)自身的容積。提示弱精子的容積調節(jié)機制異常,導致容積調節(jié)能力減弱。氯通道阻斷劑5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)benzoic acid NPPB(100mmol/L)和4,4'-Diisothiocyano-2,2'-stilbenedisulfonic acid DIDS(100mmol/L)均可以顯著地抑制正常精子在低滲環(huán)境中的調節(jié)性容積回縮能力(P0.01),導致正常精子的容積增大;而對弱精子的容積幾乎沒有影響(P0.05),表明弱精子對氯通道阻斷劑不敏感,提示弱精子的氯通道表達(表達量或類型)異常。細胞外滲透壓從330 m Osm/kg降低到290 m Osm/kg時,正常精子的多項運動參數(shù)如前向運動(PR)百分比、直線運動速率(VSL)、曲線運動速率(VCL)、平均路徑速率(VAP)的數(shù)值均明顯增加,表明正常精子在低滲液中的的運動明顯增強,而弱精子動參數(shù)如前向運動(PR)百分比、直線運動速率(VSL)、曲線運動速率(VCL)、平均路徑速率(VAP)的數(shù)值均明顯減小,表明弱精子在低滲液中的運動則顯著減弱。NPPB和DIDS在等滲液(BWW330)和低滲液(BWW290)中均明顯抑制正常精子和弱精子的運動,其中DIDS的抑制作用比NPPB更強,NPPB在BWW290中對正常精子運動的抑制作用大于弱精子。結果提示氯通道的激活在精子運動過程中起重要作用。流式細胞術的檢測結果顯示,弱精子Cl C-3氯通道蛋白的表達量明顯低于正常精子。進一步用激光共聚焦免疫熒光技術定位分析Cl C-3氯通道在精子細胞中的分布,結果顯示,Cl C-3氯通道蛋白在正常精子和弱精子的頸部及尾部均有表達,但弱精子頸部Cl C-3的表達明顯弱于正常精子細胞(P0.01)。用免疫熒光技術,在正常精子和弱精子細胞中均檢測不到Cl C-5和Cl C-7氯通道的表達。結論:1)弱精子在低滲環(huán)境下的容積調節(jié)能力明顯弱于正常精子,氯通道在精子的容積調節(jié)過程中起重要作用;2)低滲刺激可以促進正常精子的運動,但弱精子在低滲環(huán)境中的運動能力明顯降低;3)氯通道是調節(jié)精子運動能力重要因素;4)容積敏感性氯通道Cl C-3在正常精子的表達明顯強于弱精子,尤其是在精子頸部的表達,提示精子頸部氯通道的激活可能是調節(jié)精子運動的關鍵因素。
【關鍵詞】：弱精子癥 細胞容積調節(jié) ClC-3氯通道 精子運動
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R698.2
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 1 前言11-26
• 1.1 精子的運動11-14
• 1.1.1 影響精子運動的因素11-13
• 1.1.2 精子運動功能的主要檢測方法13-14
• 1.2 弱精子癥14-18
• 1.2.1 病因14-18
• 1.2.2 弱精子癥的診斷18
• 1.3 細胞的容積調節(jié)功能18-22
• 1.3.1 體細胞的容積調節(jié)功能18-20
• 1.3.2 精子細胞的容積調節(jié)功能20-22
• 1.4 細胞容積的測量22-24
• 1.5 研究目的24-25
• 1.6 研究意義25-26
• 2 實驗材料與方法26-37
• 2.1 實驗材料26-29
• 2.1.1 臨床精液樣本的收集與處理26-28
• 2.1.2 實驗儀器28-29
• 2.2 常用液體和試劑的配制29-31
• 2.3 精子形態(tài)的觀察31
• 2.4 精子細胞的孵育31
• 2.5 流式細胞術技術檢測精子細胞的容積31-32
• 2.6 精子胞質小滴的觀察32-33
• 2.7 計算機輔助精液分析系統(tǒng)（CASA）檢測精子的運動情況33-35
• 2.8 免疫熒光技術檢測 ClC 通道在人類精子上表達與定位35
• 2.9 流式細胞術檢測ClC-3 蛋白在正常精子與弱精子中的表達35-36
• 2.10 統(tǒng)計學方法36-37
• 3 實驗結果37-61
• 3.1 精子的形態(tài)37-38
• 3.2 精子細胞的容積調節(jié)38-41
• 3.2.1 低滲刺激下精子的容積調節(jié)能力38-39
• 3.2.2 氯通道阻斷劑對精子容積調節(jié)的影響39-41
• 3.2.2.1 NPPB對精子容積調節(jié)的影響39-40
• 3.2.2.2 DIDS對精子容積調節(jié)的影響40-41
• 3.2.2.3 不同滲透壓氯通道阻斷劑對精子存活率的影響41
• 3.3 精子胞質小滴(CDS)的觀察41-42
• 3.4 計算機輔助精液分析系統(tǒng)（CASA）檢測精子運動能力的變化42-55
• 3.4.1 正常精子和弱精子在不同滲透壓環(huán)境中運動能力的改變42-45
• 3.4.2 氯通道阻斷劑對等滲環(huán)境中正常精子和弱精子運動能力的抑制作用45-50
• 3.4.2.1 NPPB 對等滲液體中正常精子和弱精子運動的抑制作用45-47
• 3.4.2.2 DIDS 對等滲液體中正常精子和弱精子運動的抑制作用47-50
• 3.4.3 氯通道阻斷劑對低滲刺激下正常精子和弱精子運動能力的抑制作用50-55
• 3.5 正常精子和弱精子細胞上 ClC 氯通道的表達與定位55-61
• 3.5.1 ClC-3 氯通道在正常和弱精子上的定位情況55
• 3.5.2 ClC-3 蛋白在正常精子和弱精子頸部的表達55-58
• 3.5.3 流式細胞技術檢測 ClC-3 氯通道蛋白在正常精子和弱精子上的表達58-59
• 3.5.4 ClC-5 和 ClC-7 氯通道在正常和弱精子上的表達情況59-61
• 討論61-65
• 結論65-66
• 總結與展望66-67
• 參考文獻67-76
• 在校期間科研情況76-77
• 附錄 中英文縮略詞表77-78
• 致謝78

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