本文關(guān)鍵詞：根據(jù)細(xì)胞周期聯(lián)合使用他克莫司和霉酚酸酯治療系膜增生性腎病的實驗研究

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【摘要】：系膜細(xì)胞異常增殖是增生性腎小球疾病共同的病理改變,系膜細(xì)胞過度增殖可引起系膜基質(zhì)增多,最后導(dǎo)致腎小球硬化、終末期腎衰竭的發(fā)生。因此,抑制系膜細(xì)胞過度增殖可以延緩、阻止腎小球疾病的進展。從2008年開始,本課題組開始探索按照細(xì)胞周期動力學(xué)原理選用兩種可以將細(xì)胞周期阻滯于不同時相的免疫抑制劑,聯(lián)合治療系膜增生性腎小球疾病,這種用藥方案是否具有更好的治療效果,本課題將予以研究。本實驗包括以下五部分:第一部分他克莫司和霉酚酸酯對體外培養(yǎng)的人系膜細(xì)胞周期的影響目的:探討他克莫司和霉酚酸酯對人系膜細(xì)胞細(xì)胞周期的作用。方法:人系膜細(xì)胞分為對照組和用藥組,用藥組分別加入1μmol/L、5μmol/L的他克莫司或2.5μmol/L、10μmol/L的霉酚酸酯,分別培養(yǎng)24h、48h、72h,用MTT法測細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞儀測細(xì)胞周期、流式細(xì)胞儀測細(xì)胞凋亡。結(jié)果:5μmol/L他克莫司作用于人系膜細(xì)胞48 h,細(xì)胞在S期的比例下降了41%,在G0/G1期的百分比增加,1μmol/L和5μmol/L的他克莫司作用48 h均未對人系膜細(xì)胞的細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響。2.5μmol/L和10μmol/L的霉酚酸酯作用24,48以及72h均可抑制人系膜細(xì)胞的增殖,明顯抑制細(xì)胞進入G2/M期,2.5μmol/L和10μmol/L的霉酚酸酯作用于人系膜細(xì)胞48h均可引起細(xì)胞凋亡且呈劑量依賴性,10μmol/L的霉酚酸酯引起的細(xì)胞凋亡更明顯。結(jié)論:他克莫司可以阻斷人系膜細(xì)胞由G1期進入S期,霉酚酸酯可以阻斷人系膜細(xì)胞由S期進入G2期,二者可以將細(xì)胞周期阻滯于不同時相。第二部分他克莫司和霉酚酸酯抑制人系膜細(xì)胞周期性增殖的機制目的:探討他克莫司和霉酚酸酯抑制人系膜細(xì)胞周期性增殖的機制。方法:實驗1分為正常對照組(CTL組)、TGF-β1組、正常對照+他克莫司組(CTL+TAC組)、TGF-β1+他克莫司組(TGF-β1+TAC組)。實驗2分為正常對照組(CTL組)、PDGF組、正常對照組+霉酚酸酯組(CTL+MMF組)、PDGF+霉酚酸酯組(PDGF+MMF組)。分別用Western blotting法檢測各組Smad 2蛋白質(zhì)的表達、p38蛋白質(zhì)磷酸化的水平。結(jié)果:Western Blotting結(jié)果 1:與CTL組相比,TGF-β1組Smad 2蛋白質(zhì)表達水平顯著上調(diào)(P0.01);與CTL組相比,CTL+TAC組Smad 2蛋白質(zhì)表達水平明顯下降(P0.01);與TGF-β1組相比,TGF-β1+TAC組Smad 2蛋白質(zhì)表達水平降低(P0.01)。Western Blotting結(jié)果 2:與CTL組相比,PDGF組PP38/P38顯著上調(diào)(P0.01);與CTL組相比,CTL+MMF組PP38/P38明顯下降(P0.01);與PDGF組相比,PDGF+MMF組PP38/P38降低(P0.01)。結(jié)論:他克莫司通過影響TGF-β1/Smad 2信號通路從而抑制系膜細(xì)胞增殖,霉酚酸酯通過影響p38信號通路從而抑制系膜細(xì)胞增殖。第三部分根據(jù)細(xì)胞周期聯(lián)合使用他克莫司和霉酚酸酯抑制體外培養(yǎng)的人系膜細(xì)胞增殖目的:研究與使用單藥相比,他克莫司與霉酚酸酯聯(lián)合使用抑制體外培養(yǎng)的人系膜細(xì)胞增殖效果是否更好。方法:人系膜細(xì)胞隨機分為正常對照組(CTL組)、PDGF組、PDGF+他克莫司組(PDGF+T組)、PDGF+霉酚酸酯組(PDGF+M組)、PDGF+他克莫司組+霉酚酸酯組(PDGF+T+M組)。CTL組為常規(guī)培養(yǎng)的HMC;PDGF組用20ng/ml的PDGF刺激HMC,繼續(xù)培養(yǎng)48h;PDGF+T組用20ng/ml的PDGF刺激HMC,培養(yǎng)24h,用5μmol/L TAC處理細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)24h;PDGF+M組:用20ng/ml的PDGF刺激HMC,培養(yǎng)24h,用10μmol/L MMF處理細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)24h;PDGF+T+M組:用20ng/ml的PDGF刺激HMC,培養(yǎng)24h,用2.5μmol/L TAC和5μmol/L MMF處理細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)24h。采用免疫熒光染色的方法檢測Ki67陽性的細(xì)胞核比例,采用Western blot的方法檢測Cyclin D1蛋白質(zhì)的表達。結(jié)果:免疫熒光染色結(jié)果證實,與CTL組相比,PDGF組Ki67陽性的細(xì)胞核比例明顯升高(P0.01);與PDGF組相比,PDGF+T組和PDGF+M組Ki67陽性的細(xì)胞核比例明顯下降(P0.01);與PDGF+T組和PDGF+M組相比,PDGF+T+M組Ki67陽性的細(xì)胞核比例降低(P0.01);PDGF+T組和PDGF+M組無統(tǒng)計學(xué)差異。Western Blotting結(jié)果表明,與CTL組相比,PDGF組Cyclin D1蛋白質(zhì)表達水平顯著上調(diào)(P0.01);與PDGF組相比,PDGF+T組和PDGF+M組Cyclin D1蛋白質(zhì)表達水平明顯下降(P0.01);與PDGF+T組和PDGF+M組相比,PDGF+T+M組Cyclin D1蛋白質(zhì)表達水平降低(P0.01)。結(jié)論:他克莫司與霉酚酸酯聯(lián)合使用并且劑量減半,抑制體外培養(yǎng)的人系膜細(xì)胞增殖的作用更強。第四部分根據(jù)細(xì)胞周期聯(lián)合使用他克莫司和霉酚酸酯抑制狼瘡性腎炎小鼠系膜細(xì)胞增殖目的:研究與使用單藥相比,他克莫司與霉酚酸酯聯(lián)合使用抑制狼瘡性腎炎小鼠系膜細(xì)胞增殖效果是否更好。方法:隨機分為野生型小鼠組(Wt組)、狼瘡型小鼠組(Lupus組)、狼瘡型小鼠+他克莫司組(Lupus+TAC組)、狼瘡型小鼠+霉酚酸酯組(Lupus+MMF組)、狼瘡型小鼠+他克莫司+霉酚酸酯組(Lupus+TAC+MMF組)。Lupus+TAC組為狼瘡型小鼠使用1mg/kgd TAC腹腔注射;Lupus+MMF組為狼瘡型小鼠使用60mg/kgd MMF灌胃;Lupus+TAC+MMF組為狼瘡型小鼠使用0.5mg/kgd TAC腹腔注射+30mg/kgd MMF灌胃。Lupus+TAC組、Lupus+MMF組和Lupus+TAC+MMF組從小鼠3月齡時開始用藥,6月齡時實驗結(jié)束,5組實驗動物同時處死,留取腎組織進行PAS染色、MASSON染色觀察各組腎臟系膜細(xì)胞增生的情況,采用免疫組化的方法檢測Ki67和PDGF的表達,采用Western blot的方法檢測Cyclin D1、PDGF蛋白質(zhì)的表達。結(jié)果:PAS和MASSON染色結(jié)果顯示,Lupus組小鼠系膜細(xì)胞明顯增生,Lupus+TAC組、Lupus+MMF組的病理改變較Lupus組有所減輕,Lupus+TAC+MMF組與Lupus+TAC組、Lupus+MMF組相比,系膜細(xì)胞增生減輕。免疫組化結(jié)果顯示,Lupus組可見到Ki67、PDGF表達較Wt組明顯增高(P0.01),Lupus+TAC組、Lupus+MMF組較Lupus組的表達顯著減少(P0.01),Lupus+TAC+MMF組與Lupus+TAC組、Lupus+MMF組相比,Ki67、PDGF表達明顯減少(P0.01)。Western Blotting結(jié)果表明,Lupus組可見到Cyclin D1、PDGF表達較Wt組明顯增高(P0.01),Lupus+TAC組、Lupus+MMF組較Lupus組的表達顯著減少(P0.01),Lupus+TAC+MMF組與Lupus+TAC組、Lupus+MMF組相比,Cyclin D1、PDGF表達明顯減少(P0.01)。結(jié)論:他克莫司與霉酚酸酯聯(lián)合使用并且劑量減半,在狼瘡性腎炎小鼠體內(nèi)抑制系膜細(xì)胞增殖的作用更強。第五部分根據(jù)細(xì)胞周期聯(lián)合使用他克莫司和霉酚酸酯抑制狼瘡性腎炎患者系膜細(xì)胞增殖目的:觀察根據(jù)細(xì)胞周期聯(lián)合使用他克莫司與霉酚酸酯抑制狼瘡性腎炎患者系膜細(xì)胞增殖的效果,并且研究該用藥方案的治療效果和不良反應(yīng)。方法:6例經(jīng)腎組織穿刺活檢明確病理類型為IV型的狼瘡性腎炎患者,接受他克莫司(2mg,每天口服兩次)、霉酚酸酯(500mg,每天口服兩次)、甲基潑尼松龍聯(lián)合治療,治療6個月并進行隨訪。隨訪結(jié)束后,再次進行腎組織穿刺活檢。比較6位患者治療前后SLADAI評分、24小時蛋白尿、血Scr水平、血白蛋白水平、抗ds DNA抗體、補體C3等臨床指標(biāo),采用免疫組化法檢測腎組織中Ki67、PDGF、Cyclin D1的表達。結(jié)果:這6位患者經(jīng)過他克莫司和霉酚酸酯聯(lián)合治療,SLADAI評分、24小時蛋白尿、血Scr水平、血白蛋白水平等臨床指標(biāo)均明顯好轉(zhuǎn),腎臟病理損傷減輕,PDGF、Ki67、Cyclin D1在系膜細(xì)胞中的表達明顯減少,未發(fā)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)。結(jié)論:根據(jù)細(xì)胞周期聯(lián)合使用他克莫司與霉酚酸酯抑制狼瘡性腎炎患者系膜細(xì)胞增殖的效果顯著,該用藥方案的治療效果較好,不良反應(yīng)少,安全性高。
【關(guān)鍵詞】：他克莫司 霉酚酸酯 系膜細(xì)胞 細(xì)胞周期 聯(lián)合用藥
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R692
【目錄】：

• 中文摘要7-13
• 英文摘要13-21
• 中英文縮略表21-22
• 前言22-24
• 參考文獻23-24
• 第一部分 他克莫司和霉酚酸酯對體外培養(yǎng)的人系膜細(xì)胞周期的影響24-34
• 1 材料與方法25-27
• 1.1 細(xì)胞株與試劑25
• 1.2 細(xì)胞培養(yǎng)25
• 1.3 MTT法測細(xì)胞增殖25-26
• 1.4 流式細(xì)胞儀測細(xì)胞周期26
• 1.5 流式細(xì)胞儀測細(xì)胞凋亡26
• 1.6 統(tǒng)計學(xué)分析26-27
• 2 結(jié)果27-31
• 3 討論31-32
• 4 參考文獻32-34
• 第二部分 他克莫司和霉酚酸酯抑制體外培養(yǎng)的人系膜細(xì)胞增殖的機制34-44
• 1 材料與方法35-38
• 1.1 細(xì)胞株與試劑35
• 1.2 細(xì)胞培養(yǎng)35
• 1.3 實驗分組35-36
• 1.4 用藥方法36
• 1.5 蛋白印跡(Western blot)36-37
• 1.6 統(tǒng)計學(xué)分析37-38
• 2 結(jié)果38-41
• 3 討論41-42
• 4 參考文獻42-44
• 第三部分 根據(jù)細(xì)胞周期聯(lián)合使用他克莫司和霉酚酸酯抑制體外培養(yǎng)的人系膜細(xì)胞增殖44-55
• 1 材料與方法45-48
• 1.1 細(xì)胞株與試劑45
• 1.2 細(xì)胞培養(yǎng)45
• 1.3 實驗分組45
• 1.4 用藥方法45-46
• 1.5 免疫熒光染色檢測Ki67陽性的細(xì)胞核比例46
• 1.6 蛋白印跡(Western blot)46-47
• 1.7 統(tǒng)計學(xué)分析47-48
• 2 結(jié)果48-52
• 3 討論52-53
• 4 參考文獻53-55
• 第四部分 根據(jù)細(xì)胞周期聯(lián)合使用他克莫司和霉酚酸酯抑制狼瘡性腎炎小鼠系膜細(xì)胞增殖55-70
• 1 材料與方法56-60
• 1.1 實驗動物56
• 1.2 主要儀器和試劑56
• 1.3 實驗分組56
• 1.4 實驗方法56-57
• 1.5 PAS染色57
• 1.6 MASSON染色57
• 1.7 免疫組化法檢測Ki67和PDGF的表達57-58
• 1.8 蛋白印跡(Western blot)58-59
• 1.9 統(tǒng)計學(xué)分析59-60
• 2 結(jié)果60-67
• 3 討論67-68
• 4 參考文獻68-70
• 第五部分 根據(jù)細(xì)胞周期聯(lián)合使用他克莫司和霉酚酸酯抑制狼瘡性腎炎患者系膜細(xì)胞增殖70-83
• 1 資料與方法71-75
• 1.1 研究對象納入標(biāo)準(zhǔn)71
• 1.2 研究對象排除標(biāo)準(zhǔn)71-72
• 1.3 治療方法72
• 1.4 注意事項72-73
• 1.5 所有入試患者臨床資料73
• 1.6 腎臟病理資料73
• 1.7 主要儀器和試劑73-74
• 1.8 免疫組化法檢測腎組織中Ki67、PDGF、Cyclin D1的表達74-75
• 2 結(jié)果75-80
• 3 討論80-81
• 4 參考文獻81-83
• 結(jié)論83-84
• 綜述84-93
• 參考文獻88-93
• 致謝93-94
• 在學(xué)期間承擔(dān)/參與的科研課題與研究成果94-96
• 個人簡歷96

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 劉俊鐸,沈克勤,劉志紅,陳惠萍,黎磊石;彌漫增殖型狼瘡性腎炎按血管病變?yōu)榛A(chǔ)的病理分型探討[J];腎臟病與透析腎移植雜志;1998年03期

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本文編號：830925