本文關(guān)鍵詞：TLR4基因沉默對(duì)兔頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊血管生及細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制探討

  更多相關(guān)文章： Toll樣受體4 動(dòng)脈粥樣硬化 RNA干擾 信號(hào)通路 血管新生 細(xì)胞凋亡

【摘要】：背景:動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是心肌梗死、腦卒中和外周血管疾病的主要病理基礎(chǔ),具有發(fā)病率高、致殘率高、治療費(fèi)用高的特點(diǎn)。目前,心血管疾病位居人類(lèi)各種致死病因的首位。因而動(dòng)脈粥樣硬化的防治具有重大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。AS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,具有多種學(xué)說(shuō)。目前研究認(rèn)為AS是一種發(fā)生在血管壁的慢性炎癥性疾病,以血管壁內(nèi)脂質(zhì)沉積、炎癥細(xì)胞聚集為特征,免疫反應(yīng)貫穿于AS的始終。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)作為一種模式識(shí)別受體參與了AS的形成和發(fā)展。易損斑塊(vulnerable plaque,VP)的破裂是急性心血管事件的主要原因,影響易損斑塊的原因包括:脂質(zhì)核心的大小、纖維帽的厚度、炎癥反應(yīng)和血流動(dòng)力學(xué)等。研究發(fā)現(xiàn),動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的新生血管是影響斑塊穩(wěn)定性的核心事件,并貫穿于AS發(fā)生發(fā)展乃至斑塊破裂的整個(gè)過(guò)程。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中存在著多種細(xì)胞凋亡和壞死。因而抑制斑塊內(nèi)血管新生和減少細(xì)胞凋亡是穩(wěn)定斑塊、防止斑塊破裂的重要手段。目的:新生血管和細(xì)胞凋亡在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展乃至破裂過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)擬應(yīng)用si RNA沉默Toll樣受體4(TLR4)基因,觀察兔頸動(dòng)脈粥樣斑塊中血管新生和細(xì)胞凋亡情況,為動(dòng)脈粥樣硬化的防治提供新的機(jī)制和思路。方法:本研究分二部分1.應(yīng)用高脂喂養(yǎng)聯(lián)合球囊損傷構(gòu)建兔頸動(dòng)脈粥樣硬化模型:健康長(zhǎng)耳白兔48只,隨機(jī)分為對(duì)照組(control group)、模型組(model group)、TLR4陰性對(duì)照組(si RNA-negative group)、TLR4下調(diào)組(si RNA-TLR4 group)。(1)于喂養(yǎng)起始、5周、10周時(shí)取血,集中測(cè)定血脂水平;(2)留取頸動(dòng)脈標(biāo)本,進(jìn)行病理學(xué)切片HE染色,測(cè)量?jī)?nèi)膜、中膜厚度,計(jì)算斑塊面積百分比;免疫組化測(cè)定斑塊內(nèi)CD31、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)表達(dá)情況;TUNEL法檢測(cè)斑塊內(nèi)細(xì)胞凋亡情況;(3)Real-time PCR測(cè)定TLR4、NF-κB、HIF-1α、VEGF m RNA表達(dá)情況;(4)Western-blot測(cè)定TLR4、NF-κB、HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)情況;(5)ELISA測(cè)定血清TNF-α、IL-6水平。2.體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human vein umbilical vein endothelial cell,HUVEC)。(1)脂多糖(LPS)以不同時(shí)間、濃度刺激HUVEC,觀察TLR4 m RNA表達(dá)達(dá)峰情況;(2)應(yīng)用流式細(xì)胞儀技術(shù),LPS以1μg/ml、10μg/ml刺激HUVEC0h、6h、24h、36h、48h觀察細(xì)胞凋亡情況;(3)設(shè)計(jì)合成兩條針對(duì)HUVEC TLR4的sh RNA,以慢病毒為載體包裝sh RNA-TLR4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVEC,此后分為三組,control group、sh RNA1-TLR4 group和sh RNA2-TLR4 group。應(yīng)用LPS 1μg/ml刺激24h,檢測(cè)TLR4 m RNA和蛋白表達(dá)情況,計(jì)算抑制效率;檢測(cè)NF-κB、HIF-1α、VEGF m RNA和蛋白表達(dá)情況(4)MTT法檢測(cè)LPS刺激前后control group、sh RNA1-TLR4 group和sh RNA2-TLR4 group三組細(xì)胞增殖情況;流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期分布情況;(5)劃痕愈合實(shí)驗(yàn)(Wound healing)實(shí)驗(yàn)測(cè)定LPS刺激前后三組細(xì)胞遷移能力;(6)成管實(shí)驗(yàn)觀察三組細(xì)胞成管能力。結(jié)果:1.(1)頸總動(dòng)脈球囊損傷模型:手術(shù)成功率81.8%;(2)高脂喂養(yǎng)后兔血脂水平明顯升高,但各組同一時(shí)點(diǎn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);(3)HE染色結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組大部分頸總動(dòng)脈有粥樣硬化斑塊形成,si RNA-TLR4組較其他各組內(nèi)膜/中膜厚度比、斑塊面積百分比減少;免疫組化提示頸總動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)有CD31、HIF-1α表達(dá),且在si RNA-TLR4組的表達(dá)小于其他各組;TUNEL法染色提示,實(shí)驗(yàn)各組斑塊內(nèi)有細(xì)胞凋亡的發(fā)生,si RNA-TLR4組的表達(dá)小于其他各組(p0.05);(4)RT-PCR、Western-blot提示si RNA-TLR4組的TLR4、NF-κB、HIF-1α、VEGF表達(dá)水平較模型組下降(p0.05)。2.(1)LPS刺激HUVEC,激活TLR4具有濃度和時(shí)間依賴(lài)性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS 1μg/ml刺激24小時(shí)可使TLR4的表達(dá)達(dá)到峰值;(2)流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn),LPS 1μg/ml或10μg/ml刺激HUVEC 6小時(shí)會(huì)使細(xì)胞凋亡達(dá)到峰值;sh RNA組的細(xì)胞凋亡率下降(p0.05);(3)RT-PCR、Western-blot提示sh RNA-TLR4組的TLR4、NF-κB、VEGF表達(dá)下降(p0.05),而HIF-1α表達(dá)水平無(wú)明顯差異(p0.05);(4)細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),sh RNA-TLR4組的細(xì)胞增殖能力下降(p0.05),成管能力低于對(duì)照組(p0.05),而遷移能力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。結(jié)論:1.球囊損傷聯(lián)合高脂喂養(yǎng)兔10周可以成功建立兔頸動(dòng)脈粥樣硬化模型;si RNA-TLR4可通過(guò)抑制TLR4、NF-κB信號(hào)通路的活化減弱下游炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá)而抑制炎癥反應(yīng),抑制HIF-1α、VEGF的表達(dá)而減少粥樣斑塊內(nèi)新生血管的發(fā)生,并減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生從而穩(wěn)定斑塊;TLR4基因沉默穩(wěn)定斑塊的作用獨(dú)立于降脂效應(yīng)。2.LPS刺激HUVEC激活TLR4具有濃度和時(shí)間依賴(lài)性;LPS刺激HUVEC可使細(xì)胞達(dá)到凋亡,sh RNA-TLR4可通過(guò)抑制TLR4、NF-κB信號(hào)通路活化使細(xì)胞凋亡率下降;LPS刺激細(xì)胞后可通過(guò)活化TLR4、NF-κB信號(hào)通路使VEGF表達(dá)增加進(jìn)而促進(jìn)新生血管生成,而sh RNA下調(diào)TLR4后可弱化這種效應(yīng),并不通過(guò)HIF-1α傳遞這種效應(yīng);下調(diào)TLR4基因抑制細(xì)胞增殖,而對(duì)遷移能力無(wú)明顯影響。
【關(guān)鍵詞】：Toll樣受體4 動(dòng)脈粥樣硬化 RNA干擾 信號(hào)通路 血管新生 細(xì)胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R543.4
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 縮略語(yǔ)/符號(hào)說(shuō)明12-14
• 前言14-17
• 研究現(xiàn)狀、成果14-15
• 研究目的、方法15-17
• 一、TLR4基因沉默對(duì)兔頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊血管新生和細(xì)胞凋亡的影響17-60
• 1.1 對(duì)象和方法17-33
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物17
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料及儀器17-21
• 1.1.3 實(shí)驗(yàn)方法21-33
• 1.2 結(jié)果33-45
• 1.2.1 模型建立情況33-37
• 1.2.2 病理分析結(jié)果37-41
• 1.2.3 RT-PCR測(cè)定TLR4信號(hào)通路分子mRNA表達(dá)41-43
• 1.2.4 Western-blotting檢測(cè)TLR4信號(hào)通路分子蛋白的表達(dá)43-45
• 1.2.5 ELISA檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β 表達(dá)水平45
• 1.3 討論45-59
• 1.3.1 動(dòng)脈粥樣硬化模型的建立45-47
• 1.3.2 RNA干擾技術(shù)47-51
• 1.3.3 TLR4介導(dǎo)信號(hào)通路與動(dòng)脈粥樣硬化51-53
• 1.3.4 TLR4介導(dǎo)信號(hào)通路與斑塊內(nèi)血管新生53-57
• 1.3.5 TLR4介導(dǎo)信號(hào)通路與斑塊內(nèi)細(xì)胞凋亡57-59
• 1.4 小結(jié)59-60
• 二、RNAi下調(diào)TLR4對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、成管及凋亡的影響60-88
• 2.1 對(duì)象和方法60-71
• 2.1.1 對(duì)象60-62
• 2.1.2 方法62-71
• 2.2 結(jié)果71-81
• 2.2.1 HUVEC生長(zhǎng)曲線71-72
• 2.2.2 脂多糖對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響72
• 2.2.3 不同濃度LPS及不同刺激時(shí)間對(duì)HUVEC TLR4活性的影響72-73
• 2.2.4 shRNA-TLR4質(zhì)粒的構(gòu)建及慢病毒的包裝73
• 2.2.5 RT-PCR測(cè)定TLR4信號(hào)通路分子mRNA表達(dá)73-74
• 2.2.6 Western-blotting檢測(cè)TLR4信號(hào)通路分子蛋白的表達(dá)74-76
• 2.2.7 細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)76-81
• 2.2.7.1 劃痕實(shí)驗(yàn)76
• 2.2.7.2 MTT76-77
• 2.2.7.3 細(xì)胞周期檢測(cè)77-78
• 2.2.7.4 細(xì)胞成管能力檢測(cè)78-79
• 2.2.7.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)79-81
• 2.3 討論81-87
• 2.3.1 內(nèi)皮細(xì)胞的主要生理功能及與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系82
• 2.3.2 下調(diào)TLR4對(duì)HUVEC細(xì)胞TLR4信號(hào)通路的影響82-83
• 2.3.3 TLR4基因?qū)?nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響及可能機(jī)制83-84
• 2.3.4 TLR4基因?qū)?nèi)皮細(xì)胞遷移能力的影響及可能機(jī)制84
• 2.3.5 TLR4基因?qū)?nèi)皮細(xì)胞成管的影響及可能機(jī)制84-85
• 2.3.6 TLR4基因?qū)?nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響及可能機(jī)制85-87
• 2.4 小結(jié)87-88
• 全文總結(jié)88-89
• 論文創(chuàng)新點(diǎn)89
• 局限性89-90
• 參考文獻(xiàn)90-100
• 發(fā)表論文和參加科研情況100-101
• 綜述 血管新生與動(dòng)脈粥樣硬化研究進(jìn)展101-111
• 綜述參考文獻(xiàn)106-111
• 致謝111

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 ;Cost-effective method of siRNA preparation and its application to inhibit hepatitis B virus replication in HepG2 cells[J];World Journal of Gastroenterology;2005年09期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 丁士芳;新生血管與斑塊穩(wěn)定性的關(guān)系及VEGF基因干預(yù)的研究[D];山東大學(xué);2007年

，

本文編號(hào)：819304