本文關(guān)鍵詞：miR-483-3p對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤增殖、凋亡、侵襲及遷移的影響及作用機(jī)制研究

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【摘要】：研究背景神經(jīng)母細(xì)胞瘤(Neuroblastoma,NB)是嬰幼兒最常見的惡性實(shí)性腫瘤,其發(fā)病率約占兒童腫瘤的7%-10%。神經(jīng)母細(xì)胞瘤一般起源于交感神經(jīng)節(jié)或腎上腺髓質(zhì)的原始神經(jīng)嵴細(xì)胞,男性發(fā)病率略高。與其它腫瘤相比,神經(jīng)母細(xì)胞瘤惡性程度高,常在短期內(nèi)突破包膜而浸潤周圍組織及器官而發(fā)生轉(zhuǎn)移。原則上有交感神經(jīng)節(jié)的部位均可發(fā)生腫瘤,頸部、胸部、腹部及腹膜后均是神經(jīng)母細(xì)胞瘤的好發(fā)部位。多種分子生物學(xué)的異常被認(rèn)為與神經(jīng)母細(xì)胞瘤有著密切的關(guān)系,如MYCN異常表達(dá)、抑癌基因序列1p36.1及1p36.2缺失等分子生物學(xué)的異常均已逐步成為兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤分級的重要指標(biāo)。盡管神經(jīng)母細(xì)胞瘤的分子生物學(xué)研究已取得重大進(jìn)展,然而兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤的預(yù)后并未有明顯的改善,探索新的分子靶向治療途徑是我們研究的重要方向。微小RNA(microRNA, miRNA)是一類廣泛存在真核生物體內(nèi)的長度為21～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA。miRNA通過與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA induced silence complex, RISC)結(jié)合形成非對稱性的RISC,而結(jié)合RISC后可與靶基因結(jié)合而達(dá)到降解mRNA或抑制mRNA轉(zhuǎn)錄后的翻譯,最終通過調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)而在體內(nèi)多個(gè)重要環(huán)節(jié)中發(fā)揮作用。大量研究表明miRNA在腫瘤中存在明顯異常表達(dá),而niRNA的異常表達(dá)對腫瘤的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移均發(fā)揮著重要的作用。前期Guo等通過miRNA基因芯片檢測高危組神經(jīng)母細(xì)胞瘤與低危組神經(jīng)母細(xì)胞瘤的miRNA表達(dá)譜發(fā)現(xiàn),高危組與低危組神經(jīng)母細(xì)胞瘤的miRNA表達(dá)譜存在差異,如在高危組中,miR-17-92, miR-181, miR-21, miR-380-5p, miR-483-3p等明顯上調(diào),而miR-34a, miR-542-5p, let-7, miR-204等明顯下調(diào)。功能實(shí)驗(yàn)中亦證實(shí)多種miRNA在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、凋亡、分化、侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。miR-483最早于人體新生兒的肝臟組織中發(fā)現(xiàn),其定位于染色體11p15的IGF-2基因內(nèi)含子內(nèi)。其主要包括miR-483-3p及miR-483-5p兩種,兩者均在腫瘤中發(fā)揮著重要的作用。如miR-483-3p在肝癌中發(fā)揮著癌基因的作用,通過抑制其表達(dá)后可以明顯的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡,而miR-483-5p亦被證明在腎上腺皮質(zhì)腫瘤中發(fā)揮著癌基因的作用。過往研究采用miRNA基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)高危組的神經(jīng)母細(xì)胞瘤的miR-483-3p表達(dá)量明顯高于低危組,然而其對神經(jīng)母細(xì)胞瘤的作用及機(jī)制目前尚未見報(bào)道。本研究首先通過qRT-PCR驗(yàn)證miR-483-3p在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本及細(xì)胞中的表達(dá)情況,并進(jìn)一步在細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證miR-483-3p對神經(jīng)母細(xì)胞瘤的增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移的影響,并通過計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)探索了miR-483-3p對神經(jīng)母細(xì)胞瘤發(fā)揮作用的可能機(jī)制。研究內(nèi)容與結(jié)果第一部分：miR-483-3p在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本及細(xì)胞中的表達(dá)及意義1.1目的通過qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證高危組神經(jīng)母細(xì)胞瘤(轉(zhuǎn)移瘤)及中低危組神經(jīng)母細(xì)胞瘤(原發(fā)瘤)組織標(biāo)本及細(xì)胞株中的miR-483-3p的表達(dá)差異。1.2方法①收集組織標(biāo)本,并詳細(xì)記錄組織標(biāo)本對應(yīng)的腫瘤病理類型、分級、分期、年齡、NMYC基因擴(kuò)增倍數(shù)等相關(guān)資料,標(biāo)本于液氮速凍后于-70℃冰箱內(nèi)保存。購買神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株,快速復(fù)蘇細(xì)胞后采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；②取等量組織標(biāo)本在冰上研磨(等量細(xì)胞),利用RNA提取試劑盒(操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行)提取總RNA；③使用一步法配置RNA反轉(zhuǎn)錄液后,將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;④按說明書配置RT-PCR反應(yīng)液,利用PCR儀對miR-483-3p進(jìn)行擴(kuò)增；⑤采用Quantitation-Comparative Ct軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。1.3結(jié)果高危組神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本中的miR-483-3p的表達(dá)量明顯高于低危組神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本(t=6.171, P=0.000), miR-483-3p的表達(dá)量隨著腫瘤的分期升高而升高(F=12.267,P=0.000)。神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的miR-483-3p表達(dá)量明顯高于正常細(xì)胞(F=30.998,P=0.000),惡性度高的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(SH-SY5Y、SK-N-BE)的miR-483-3p表達(dá)量亦明顯高于惡性度較低的細(xì)胞株(IMR-32)(均P0.05)。1.4結(jié)論無論是組織標(biāo)本還是細(xì)胞水平,惡性程度高的神經(jīng)母細(xì)胞瘤的miR-483-3p表達(dá)水平明顯高于惡性程度低的神經(jīng)母細(xì)胞瘤,miR-483-3p可能是神經(jīng)母細(xì)胞瘤診斷分期及預(yù)后判斷的重要指標(biāo)。第二部分：miR-483-3p對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞體外增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移的影響2.1目的明確miR-483-3p對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及遷移等功能的影響。2.2方法①人工合成miR-483-3p mimicss miR-483-3p inhibitors及陰性對照的siRNA,并采用綠色熒光蛋白進(jìn)行標(biāo)記；②使用LipolifectmainTM2000將miR-483-3p mimics、miR-483-3p inhibitors及陰性對照轉(zhuǎn)染至神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y及SK-N-BE細(xì)胞株內(nèi),并使用熒光顯微鏡確認(rèn)其的轉(zhuǎn)染效率；③采用CCK-8法檢測miR-483-3p對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y及SK-N-BE細(xì)胞株增殖活性的影響；④采用細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察miR-483-3p對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞克隆形成能力的影響；⑤流式細(xì)胞術(shù)檢測miR-483-3p對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞周期的影響；⑥Transwell法檢測miR-483-3p對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞遷移及侵襲(加基質(zhì)膠)的影響。2.3結(jié)果LipolifectmainTM2000可以成功的將miR-483-3p mimics及miR-483-3p inhibitors轉(zhuǎn)入神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y及SK-N-BE細(xì)胞株中,熒光顯微鏡均可見綠色熒光蛋白表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)轉(zhuǎn)染miR-483-3p mimics后神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y及SK-N-BE細(xì)胞株中的miR-483-3p表達(dá)量上調(diào)10-13倍(P均0.01),而轉(zhuǎn)染miR-483-3p inhibitors后神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株的miR-483-3p表達(dá)量下調(diào)2-3倍(P均0.05)。采用CCK-8法繪制的生長曲線表明上調(diào)miR-483-3p的表達(dá)可以明顯的增強(qiáng)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖能力,在miR-483-3p mimics轉(zhuǎn)染48h、72h及96h后神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y及SK-N-BE細(xì)胞的OD值明顯升高(P均0.05),而下調(diào)miR-483-3p可明顯抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖能力,其作用48h、72h及96h后OD值明顯下降(P均0.05)。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)證明miR-483-3p mimics作用后神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y及SK-N-BE細(xì)胞株的克隆形成數(shù)多于陰性對照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而下調(diào)miR-483-3p的表達(dá)后神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的克隆形成數(shù)減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明上調(diào)miR-483-3p的表達(dá)可以使得神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞處于S期及G2期的細(xì)胞明顯增加,而處于G0/G1期的細(xì)胞明顯減少,與對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),這也提示miR-483-3p mimics可以促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖,使更多細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂；而下調(diào)miR-483-3p的表達(dá)后,處于G0/G1期的細(xì)胞增多,而S期及G2期細(xì)胞減少(P0.05),細(xì)胞增殖能力下降,凋亡細(xì)胞增加。Transwell法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明niR-483-3p可以影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y及SK-N-BE細(xì)胞的遷移及侵襲能力,上調(diào)miR-483-3p表達(dá)后神經(jīng)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞遷徙及侵襲能力增強(qiáng),遷移至下孔的細(xì)胞數(shù)多于陰性對照組(P均0.05)。而轉(zhuǎn)染miR-483-3p inhibitor后下孔的細(xì)胞數(shù)較陰性對照組減少(P均0.05),即細(xì)胞的遷移及侵襲能力下降。2.4結(jié)論上調(diào)miR-483-3p可以促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖及克隆形成能力,使得神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的侵襲及遷移能力明顯提高,而抑制miR-483-3p的表達(dá)則可以抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤的增殖、侵襲及遷移能力,并促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的凋亡。miR-483-3p在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中發(fā)揮‘癌基因’的作用。第三部分：miR-483-3p靶基因的鑒定及其調(diào)控人神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞的機(jī)制3.1目的探索miR-483-3p對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞作用的可能機(jī)制,并通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)驗(yàn)證niR-483-3p與靶基因之間的關(guān)系。3.2方法①通過miRNA靶標(biāo)預(yù)測軟件(miRbase, miRwalk, Targetscan等)結(jié)合現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫資料,篩選miR-483-3p發(fā)揮作用的靶基因；②采用Western blot檢測miR-483-3p對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞相應(yīng)靶基因蛋白表達(dá)的影響。(主要步驟：a利用細(xì)胞裂解液裂解miR-483-3p mimics、miR-483-3p inhibitors及陰性對照siRNA作用后神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞,提抽蛋白；b采用BCA法進(jìn)行蛋白定量；c依據(jù)蛋白分子量配置相應(yīng)濃度積層膠及分離膠,加入電泳緩沖液,待其凝固后取等量蛋白加入泳道中進(jìn)行電泳分離蛋白；d利用電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；e封閉液封閉后依次加入一抗、二抗進(jìn)行免疫反應(yīng)；f加入ECL顯影液,進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；g凝膠圖像分析);③構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因載體,將其與miR-483-3p mimics及陰性對照siRNA共轉(zhuǎn)染神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞,進(jìn)行熒光素酶報(bào)告檢測,驗(yàn)證miR-483-3p與靶基因的3’-UTR之間的關(guān)系；④合成針對靶基因的siRNA,觀察其對靶基因蛋白表達(dá)的影響,使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后觀察其對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及遷移的影響。⑤合成上調(diào)靶基因表達(dá)的質(zhì)粒,觀察其對miR-483-3p作用后的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞功能的影響。3.3結(jié)果我們通過靶基因預(yù)測軟件篩選出了IGF-1及PUMA基因作為miR-483-3p的潛在靶標(biāo)。Western blot結(jié)果表明高表達(dá)miR-483-3p后神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞的PUMA蛋白含量降低(P0.05),而下調(diào)miR-483-3p的表達(dá)后神經(jīng)母細(xì)胞瘤的PUMA蛋白表達(dá)量較陰性對照組升高(P0.05)。然而無論是上調(diào)還是下調(diào)miR-483-3p的表達(dá),神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的IGF-1的蛋白表達(dá)變化并不明顯,與陰性對照組比較差異并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05)。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-483-3p可以與PUMA的3’-UTR結(jié)合,與miR-483-3p共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,PUMA3'-UTR表達(dá)量下調(diào),而其不能與突變型PUMA3'-UTR結(jié)合,其作用后突變型PUMA 3'-UTR并無明顯下降,兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-483-3p發(fā)揮作用與PUMA基因有關(guān),我們通過人工合成了針對PUMA基因的siRNA及高表達(dá)PUMA基因(不含3'-UTR)的質(zhì)粒。通過功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),下調(diào)PUMA蛋白表達(dá)后神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞增殖、細(xì)胞克隆形成能力明顯增強(qiáng)(P均0.05),發(fā)揮著與miR-483-3p類似的作用,而下調(diào)PUMA基因后神經(jīng)母細(xì)胞瘤的侵襲及遷移的能力并無明顯改變(P均0.05)。而轉(zhuǎn)染高表達(dá)PUMA質(zhì)粒后可使miR-483-3p作用后神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞的PUMA蛋白表達(dá)量升高,而進(jìn)一步的功能實(shí)驗(yàn)也證實(shí)上調(diào)PUMA基因的表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)miR-483-3p對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖及克隆形成的影響。3.4結(jié)論①miR-483-3p對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞發(fā)揮作用可能與抑制細(xì)胞的PUMA基因表達(dá)密切相關(guān)；②PUMA基因是一種重要的促凋亡因子,下調(diào)其表達(dá)可以明顯促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖及克隆形成能力,而上調(diào)其表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)miR-483-3p對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖及克隆形成能力；③miR-483-3p對神經(jīng)母細(xì)胞瘤的作用不僅與PUMA基因有關(guān),還可能通過調(diào)節(jié)其它基因的表達(dá)而發(fā)揮作用,具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。第四部分：miR-483-3p過表達(dá)對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞裸鼠體內(nèi)成瘤的影響4.1目的通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證niR-483-3p對裸鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤移植瘤生長的影響。4.2方法①合成miR-483-3p高表達(dá)質(zhì)粒(經(jīng)過靶基因合成、PCR擴(kuò)增、酶切、連接、轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒提抽等步驟,合成的質(zhì)粒采用PCR及基因測序進(jìn)行驗(yàn)證),合成的質(zhì)粒使用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染至神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)。②轉(zhuǎn)染后使用qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染后神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞中niR-483-3p的表達(dá)。③將轉(zhuǎn)染miR-483-3p的SH-SY5Y細(xì)胞及轉(zhuǎn)染陰性對照的SH-SY5Y細(xì)胞同時(shí)種植4-6周齡BALB/C裸鼠臀區(qū)皮下,建立裸鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤模型,觀察腫瘤體積及變化和各組腫瘤重量,計(jì)算抑瘤率,繪制腫瘤生長曲線。④取液氮中保存的動(dòng)物腫瘤組織標(biāo)本,封閉后依次加入一抗、二抗、DAB顯色,使用顯微鏡計(jì)數(shù)兩組腫瘤血管密度。⑤采用western blot檢測兩組移植瘤組織標(biāo)本中PUMA蛋白的表達(dá)。4.3結(jié)果轉(zhuǎn)染]miR-483-3p后神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞株中的miR-483-3p表達(dá)量明顯升高,與陰性對照組相比,差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。4周后穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-483-3p的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞形成的腫瘤體積明顯大于陰性對照組(P0.01),而腫瘤的重量也明顯重于陰性對照組(P0.01)。miR-483-3p轉(zhuǎn)染組的腫瘤微血管密度明顯高于陰性對照組,兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-483-3p組的動(dòng)物移植瘤標(biāo)本中PUMA蛋白較陰性對照組明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而這與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。4.4結(jié)論通過皮下注射的方法可以成功構(gòu)建裸鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤的移植瘤模型。上調(diào)miR-483-3p的表達(dá)可以明顯的促進(jìn)體內(nèi)神經(jīng)母細(xì)胞瘤腫瘤的生長及血管形成。本實(shí)驗(yàn)通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步的證實(shí)miR-483-3p發(fā)揮作用與調(diào)節(jié)PUMA蛋白表達(dá)有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：神經(jīng)母細(xì)胞瘤 miRNA 腫瘤轉(zhuǎn)移 PUMA miR-483-3p IGF
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.41
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-21
• 前言21-26
• 第一部分 MIR-483-3P在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本及細(xì)胞中的表達(dá)及意義26-41
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料27-29
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法29-32
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-35
• 1.4 討論35-39
• 1.5 小結(jié)39
• 1.6 參考文獻(xiàn)39-41
• 第二部分 MIR-483-3P對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移及侵襲的影響41-60
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料42-44
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法44-47
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-54
• 2.4 討論54-57
• 2.5 小結(jié)57
• 2.6 參考文獻(xiàn)57-60
• 第三部分 MIR-483-3P靶基因的鑒定及其調(diào)控人神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞的機(jī)制60-81
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料60-62
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法62-69
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果69-76
• 3.4 討論76-78
• 3.5 小結(jié)78-79
• 3.6 參考文獻(xiàn)79-81
• 第四部分 MIR-483-3P對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤的作用及機(jī)制研究的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)81-94
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料81-82
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法82-86
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果86-90
• 4.4 討論90-92
• 4.5 小結(jié)92-93
• 4.6 參考文獻(xiàn)93-94
• 全文總結(jié)94-95
• 綜述95-108
• 參考文獻(xiàn)102-108
• 兒童單孔腹腔鏡闌尾切除術(shù)的安全性及可行性:單中心、隨機(jī)對照研究108-123
• 摘要108-110
• ABSTRACT110-112
• 前言112-113
• 1.實(shí)驗(yàn)方法113-116
• 2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果116-118
• 3.討論118-121
• 4.結(jié)論121
• 5.參考文獻(xiàn)121-123
• 中英文對照縮略詞表123-125
• 攻讀學(xué)位期間成果125-126
• 致謝126-128
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)審稿證明128

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本文編號：797899