本文關鍵詞：TLR5靶向同種移植物放射性實時監(jiān)測及自噬在同種排斥中的調節(jié)機制

  更多相關文章： 同種移植 TLR5 ~(131)I-anti-TLR5 mAb ~(18)F-FDG 自噬

【摘要】：研究目的：迄今為止,器官移植仍是挽救終末期臟器功能衰竭而又缺乏有效替代療法患者生命的唯一手段。隨著免疫抑制療法的不斷改善和廣泛應用,術后移植物的短期存活率得到明顯提高。然而,持續(xù)的免疫損傷和長期應用免疫抑制劑產生的毒副作用仍然嚴重影響著移植物的長期存活和受體患者生活質量。因此術后對移植物耐受狀態(tài)的實時動態(tài)檢測和機體免疫耐受新的調節(jié)機制的進一步探索闡明對移植排斥反應早期診斷和治療方案的及時調整都具有重要意義。目前,除了活檢以外,移植物狀態(tài)的無創(chuàng)性檢測方法大多依賴與對急性排斥反應的生物學特征或者炎癥反應的早期檢測。然而,移植術后臨床上免疫抑制劑的廣泛使用,使急性排斥反應的監(jiān)測受到了嚴重影響,如18F-FDG(18氟標記的氟代脫氧葡萄糖)的PET/CT檢查。18F-FDG是一種在正電子發(fā)射斷層掃描成像常用的放射性藥物,近年來它被應用于移植術后移植物排斥的檢測和評價免疫抑制劑的療效。當發(fā)生急性排斥反應時,移植物對18F-FDG的攝取明顯升高,然而這種PET圖像上的強信號卻因為免疫抑制劑的使用而受到嚴重影響,有可能誤導臨床判斷。研究發(fā)現,應用了免疫抑制劑后,模型動物的移植物對18F-FDG的攝取均很低,表明18F-FDG可用來評價免疫制劑的療效,但是對評估移植物存活的長期檢測卻并不適用。由于誘導和維持供體特異性的免疫耐受是器官移植后的首要目標,因此探討發(fā)現高靈敏高特異的的與移植物耐受狀態(tài)相關的標志物對臨床器官移植后的預后判斷和及治療措施調整十分重要。TLR樣受體(Toll-like Receptor)家族是一種表達在白細胞和固有免疫細胞中的模式識別受體(PRR, pattern recognition receptor),不僅在天然免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用,而且還調節(jié)獲得性免疫。近期研究表明,TLR5很可能是一個潛在的具有免疫調節(jié)功能靶點。TLR5識別細菌表達的鞭毛蛋白,通過MyD88的級聯信號作用激活NF-κB。研究證明,TLR5在CD4+CD25+調節(jié)性T細胞(Regulatory T cell, Treg)高表達并且與之免疫抑制能力有潛在的聯系。鞭毛蛋白通過活化TLR5信號同路能夠減輕在異基因造血干細胞移植引起的急性移植物抗宿主病(acute Graft-versus-host disease, aGVHD)。我們實驗室的前期研究結果顯示在同種異體移植模型中,免疫抑制劑雷帕霉素的使用可以上調移植物TLR5和Foxp3 (Forkhead transcription factors 3,叉頭樣轉錄因子3)的表達。繼而又證實在同種異體移植模型中應用基因重組表達的鞭毛蛋白rFlic可以擴增受體CD4+CD25+Treg細胞的比例、上調Foxp3的表達、增強其抑制功能,從而達到協同誘導免疫耐受的作用。因此,我們提出科學假設：TLR5的表達有可能與雷帕霉素誘導的移植物耐受相關并且參與對移植耐受分子機制的調節(jié)。在研究過程中,我們發(fā)現自噬與TLR5和雷帕霉素均相關。自噬是一種細胞內的分解代謝過程,參與胞質內蛋白和細胞器的降解與更新。它既調節(jié)固有免疫應答,也參與調節(jié)適應性免疫應答。近來研究發(fā)現,自噬在中央耐受和外周耐受中更是起了十分關鍵的作用。在基因敲除Beclinl基因后的CD4+T細胞,缺少了自噬,在TCR刺激后,與細胞死亡相關蛋白(如procaspase-3, procaspase-8和Bim)的表達升高,更易發(fā)生凋亡。然而自噬是否在同種移植排斥過程中的發(fā)生變化,有何作用,目前仍不明確。綜上所述,本論文分為三部分對TLR5與Autophagy在同種移植耐受的實時動態(tài)顯像和分子調節(jié)機制進行了系統(tǒng)的深入研究。1、選擇免疫抑制劑雷帕霉素誘導的小鼠同種移植模型,以TLR5為靶點,制備放射性核素131-I標記的抗TLR5單克隆抗體為分子顯像劑,通過體內注射,對移植排斥模型進行動態(tài)對比監(jiān)測,為無創(chuàng)性移植耐受后的移植物實時監(jiān)測探索新的途徑;2、在同種移植模型中,通過與非特異性顯像劑18F-FDG和同種型IgG進行對比,評價TLR5作為特異性耐受顯像劑在雷帕霉素使用后對移植物的顯像價值；3、對比研究自噬在同種移植模型移植排斥過程中變化及意義,初步探討其影響同種移植排斥的可能的分子機制。第一部分 靶向TLR5的放射性核素標記抗體對雷帕霉素治療的同種移植物動態(tài)監(jiān)測研究方法1、小鼠同種移植模型的建立以C57BL/6小鼠為供體,將其背部全厚度皮膚移植到受體BALB/c小鼠,建立同種移植排斥模型；分為對照組和雷帕霉素處理組,處理組在移植術后每日腹腔注射雷帕霉素1.5mg/Kg直至對照組移植皮膚完全被排斥,對照組術后每日腹腔注射等量的PBS(phosphate buffered saline)。2、131I標記的放射性示蹤劑的制備和體外結合實驗Iogogen法制備并純化131Ⅰ-anti TLR5 mAb。分別將131Ⅰ-anti TLR5 mAb置于小鼠血清和生理鹽水中,37℃水浴,0h,12 h,24 h,48 h,72 h和96h分別檢測標記物體外穩(wěn)定性。通過BALB/c小鼠脾細胞的單位點放射性配體與受體結合分析檢測131Ⅰ-anti TLR5 mAb r Kd,, Bmax和KI值。3、131Ⅰ-anti TLR5 mAb在同種移植模型中的體內生物學分布研究在移植術后第7天向2組實驗小鼠尾靜脈分別注射131Ⅰ-anti TLR5 mAb(0.37MBq/只),在注射后1h,12h,24 h,48 h和72 h,分別各取5只小鼠,脫頸椎處死,收集血液、移植皮膚、對側正常皮膚以及各個器官組織,稱重,測量放射性,研究131Ⅰ-anti TLR5 mAb在模型小鼠體內的生物學分布狀況,并計算靶(移植皮膚)與非靶(對側正常皮膚)放射性分布的比值。4、131Ⅰ-anti TLR5 mAb在同種移植模型中的動態(tài)磷屏自顯影顯像研究在移植術后第7天向兩組實驗小鼠尾靜脈分別注射131Ⅰ-anti TLR5 mAb (0.37MBq/150 μl只),在注射后1h,12 h,24 h,48 h和72 h進行放射性磷屏自顯影顯像,觀察131Ⅰ-anti TLR5 mAb及對照抗體在移植部位的攝取狀況。另有一組雷帕霉素治療小鼠在尾靜脈注射131Ⅰ-anti TLR5 mAb前半個小時尾靜脈注射未標記的anti TLR5 mAb,進行阻斷實驗,確定131Ⅰ-anti TLR5 mAb攝取的特異性。5、免疫組織化學染色檢測TLR5的表達及與131Ⅰ-anti TLR5 mAb在移植皮膚部位攝取的相關性分析將注射131Ⅰ-anti TLR5 mAb的72 h兩組行放射性磷屏自顯影小鼠脫椎處死,完整取下其移植皮膚及受體移植床部分組織,福爾馬林固定并制成石蠟切片,進行TLR5染色。分析TLR5表達與該移植皮片攝取131Ⅰ-anti TLR5 mAb的相關性。研究結果1、131Ⅰ-anti-TLR5 mAb標記率為96.9%,比活度為458.6 MBq/mg,并且有良好的免疫學活性,Kd值為3.672 nM,最大結合量Bmax為5.388μM,半抑制濃度(IC50)和抑制常數(Ki)分別為8.89 nM和40.38 nM。131Ⅰ-anti-TLR5 mAb體外放置72 h,放射化學純度大于90%。2、體內生物學分布結果顯示,雷帕霉素治療組,注射131Ⅰ-anti-TLR5 mAb 1 h移植皮膚的%ID/g值達到最大值,為12.05±1.86,注射后72 h, T/NT值達到最大,為8.10±0.10；而131Ⅰ-anti-TLR5 mAb雖然也在排斥對照組移植部位聚集,但是明顯低于耐受組(p0.001)。TLR5阻斷組全身組織器官放射性比活度明顯降低,移植皮片部位%ID/g降低92%,表明移植部位的131Ⅰ-anti-TLR5 mAb攝取是特異性的。3、動態(tài)全身放射性自顯影圖像的結果與體內生物學分布相一致,顯示在注射12h后,’31Ⅰ-anti-TLR5 mAb在雷帕霉素耐受組移植物部位明顯濃聚且明顯高于對照組,在72 h獲得移植皮膚對比度最為清晰顯像。移植部位放射性活度分別為26,448±904 DLU/mm2(雷帕霉素治療組),9176 ± 576 DLU/mm2(移植排斥組)和3881.5±62.6 DLU/mm2(阻斷組)(p0.05)。TLR5阻斷組移植皮膚放射性濃聚圖像幾乎不可見。4,131Ⅰ-anti-TLR5 mAb在兩組實驗小鼠移植物皮膚部位的攝取與同一組織TLR5的表達呈明顯正相關(r2=0.93,P0.0001)。第二部分131Ⅰ-anti TLR5 mAb/131Ⅰ-IgG/18F-FDG在雷帕霉素治療的同種移植模型中顯像價值的評價研究方法1、建立小鼠同種移植模型以C57BL/6小鼠為供體,將其背部全厚度皮膚移植到受體BALB/c小鼠,建立同種移植排斥模型。將模型小鼠分為對照組和雷帕霉素治療組；治療組在移植術后每日腹腔注射雷帕霉素1.5 mg/Kg,直至對照組小鼠移植皮膚完全排斥,對照組術后每日腹腔注射等量的PBS。2、131I標記的放射性示蹤劑的制備和生物學活性檢測131 Ⅰ-anti TLR5 mAb制備及鑒定方法同第一部分；Iogogen法制備并純化對照同種型示蹤劑131 Ⅰ-IgG。分別將131 Ⅰ-IgG放入小鼠血清和生理鹽水中,37℃水浴,0h,12 h,24h,48 h,72 h和96 h分別檢測標記物體外穩(wěn)定性。3,131Ⅰ-anti TLR5 mAb,131Ⅰ-IgG和18F-FDG在同種移植模型動態(tài)分子顯像中的對比研究在移植術后第7天分別向兩組實驗小鼠通過尾靜脈分別注射131Ⅰ-anti TLR5mAb和131Ⅰ-IgG (0.37 MBq/150μ1只),在注射后1 h,12 h,24 h,48 h和72 h進行放射性自顯影顯像。在移植術后第10天選取兩組實驗小鼠腹腔注射18F-FDG (5.55 MBq),在注射后30 min,60 min和90 min的時間進行放射性自顯影顯像。OptiQuantTM圖像分析軟件檢測131Ⅰ-anti TLR5 mAb,131Ⅰ-IgG與18F-FDG在移植皮膚部位的濃聚狀況并進行對比分析。研究結果1、131Ⅰ-IgG標記率為96.2%,比活度為407.2 MBq/mg,在小鼠血清和生理鹽水中測定的體外穩(wěn)定性在72 h后均高于90%。2、在注射131Ⅰ-IgG 12h后顯示其在雷帕霉素治療組移植皮膚部位出現濃聚,但是其放射性活度明顯低于131Ⅰ-anti TLR5 mAb,表明131Ⅰ-anti TLR5 mAb在移植皮膚部位濃聚是標記物與TLR5受體特異性結合的結果,而非同種型IgG Fc段的非特異性結合所致。3、18F-FDG的高攝取圖像僅出現在對照組,而雷帕霉素治療組移植物對18F-FDG的攝取量很低,圖像上幾乎不可見。31Ⅰ-anti-TLR5 mAb則在雷帕霉素治療組持續(xù)高攝取。131Ⅰ-anti-TLR5 mAb與18F-FDG最高T/NT比值分別為(7.68和1.16)(p0.001)。這表明131Ⅰ-anti-TLR5 mAb對雷帕霉素應用后的移植物分子影像檢測與非特異性顯像劑相比有明顯的優(yōu)勢。第三部分同種移植排斥過程中自噬分子的表達及意義研究方法1、建立小鼠同種移植模型和雷帕霉素治療組模型方法見第一部分。2、自噬水平以及自噬發(fā)生相關基因和蛋白在移植模型盡力過程中的表達變化在小鼠同種移植模型術后的第4天,第8天,第12天和第16天,脫椎處死小鼠,分別取移植皮膚和脾,提取總mRNA和總蛋白。利用實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)檢測移植皮膚和脾細胞中自噬相關基因Beclinl,ATG5的轉錄表達水平。Western blot技術檢測移植皮膚和脾細胞中自噬相關蛋白Belcinl,ATG5和LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ表達檢測自噬發(fā)生水平。3、同種移植小鼠移植皮膚部位131 Ⅰ-anti-TLR5 mAb攝取與自噬發(fā)生水平的相關性分析以同種移植排斥組和雷帕霉素治療組小鼠移植皮膚部位免疫組織化學TLR5染色測得的TLR5表達量與相應自噬的水平做相關性分析。研究結果1、實時熒光定量PCR結果顯示在同種排斥組中,自噬相關基因Becln1和ATG5均從移植術后第8天起升高,在第12天達到高峰,在第16天下降。在雷帕霉素治療組出現同樣的趨勢,從第8天起的表達明顯高于同種移植組。而且兩組移植皮膚部位的表達均明顯高于脾細胞(p0.01)。2.Western blOt結果顯示Beclin1和ATG5蛋白表達與其基因表達水平一致：Becln1和ATG5均從移植術后第8天起升高,第12天達到高峰,第16天下降。在同種移植組,自噬相關分子LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值(自噬發(fā)生水平)在雷帕霉素治療組最高,而且在同種移植急性排斥反應較強時明顯升高,在同種移植急性排斥反應減弱后隨之降低(p0.01),表明自噬與移植排斥反應呈明顯相關。更重要的是我們發(fā)現自噬相關基因與蛋白的變化在移植皮膚部位的變化比在脾臟的變化更加顯著。3、自噬分子與TLR5表達相關性分析：同種移植排斥模型中,移植皮膚部位自噬發(fā)生水平與TLR5的表達成正相關(r2=0.79)。全文結論1.制備了131Ⅰ-anti-TLR5 mAb,經鑒定具有良好的特異性和生物學活性2.體內生物學分布結果顯示,在同種移植模型中,131Ⅰ-anti-TLR5 mAb被移植皮膚部位高攝取,顯著高于對側正常皮膚；與同種移植模型相比,雷帕霉素治療后移植皮膚部位對131Ⅰ-anti-TLR5 mAb的攝取的T/NT值更高。全身磷屏放射自顯影結果與體內生物學分布結果一致,在雷帕霉素應用后,131Ⅰ-anti-TLR5 mAb對移植物清晰顯像。3. Anti-TLR5 mAb可顯著阻斷131Ⅰ-anti-TLR5 mAb在移植皮膚部位的濃聚,證明131Ⅰ-anti-TLR5 mAb在移植皮膚部位的特異性攝取,而不是非特異性的聚集。4.同種移植皮膚部位對131Ⅰ-anti-TLR5 mAb的特異性攝取與該部位TLR5的表達成明顯正相關。5.與同種型對照抗體131Ⅰ-IgG和非特異性顯像劑18F-FDG影像學研究進行比較,131Ⅰ-anti-TLR5 mAb在雷帕霉素治療后的移植物有更高的T/NT值,具有明顯的影像學顯像優(yōu)勢和特異性。6.通過實時定量PCR和Western blot技術研究發(fā)現在同種移植模型中,自噬的相關基因、蛋白和發(fā)生水平與移植排斥反應密切相關,雷帕霉素的應用在調節(jié)移植排斥反應的同時也引起自噬水平發(fā)生相應改變。7.同種移植排斥過程中TLR5的表達和自噬的水平變化與移植排斥反應成顯著相關,可能是參與同種移植排斥的免疫調節(jié)的新機制。
【關鍵詞】：同種移植 TLR5 ~(131)I-anti-TLR5 mAb ~(18)F-FDG 自噬
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R617
【目錄】：

• 中文摘要12-20
• 英文摘要20-28
• 符號說明28-31
• 第一部分 靶向TLR5的放射性核素標記抗體對雷帕霉素治療的同種移植物動態(tài)監(jiān)測31-47
• 序言31-33
• 材料和方法33-41
• 一、實驗材料33-35
• 二、實驗儀器35-36
• 三、實驗方法36-41
• 1. 建立小鼠同種異體皮膚移植模型36
• 2. 同種移植模型分組36
• 3. Iodogen法制備~(131)I碘化標記TLR5單抗及放射化學純度分析36-37
• 4. 脾單個核細胞懸液制備37
• 5. 放射性配體與受體結合分析實驗(RBA)鑒定標記化合物生物學活性37-38
• 6. ~(131)I-anti-TLR5 mAb在同種移植模型中的體內生物學分布38-39
• 7. ~(131)Ianti-TLR5 mAb同種移植模型動態(tài)全身磷屏自顯影顯像39
• 8. TLR5在移植皮膚部位免疫組織化學染色39-40
• 9. TLR5表達與~(131)I-anti-TLR5 mAb的放射性活度相關性分析40
• 10. 統(tǒng)計學分析40-41
• 實驗結果41-44
• 一、~(131)I-anti-TLR5 mAb制備和生物學活性鑒定41
• 1. 放射性碘化標記anti-TLR5 mAb41
• 2. ~(131)I-anti-TLR5 mAb的生物學活性檢測41
• 3. ~(131)I-anti-TLR5 mAb體外穩(wěn)定性41
• 二、~(131)I-anti-TLR5 mAb在同種異體移植模型中生物學分布41-42
• 1. 雷帕霉素治療組41-42
• 2. 同種排斥對照組42
• 3. Anti-TLR5 mAb阻斷組42
• 三 ~(131)I-anti-TLR5 mAb在同種異體移植模型中的動態(tài)磷屏自顯影顯像42-43
• 1. 雷帕霉素治療組42
• 2. 同種排斥對照組42
• 3. Anti-TLR5 mAb阻斷組42-43
• 4. 圖像半定量分析43
• 四、TLR5在移植皮膚部位免疫組織化學染色43
• 五、TLR5表達與~(131)I-anti-TLR5 mAb放射性活度值的相關性分析43-44
• 討論44-47
• 第二部分 ~(131)I-anti TLR5 mAb/~(131)I-IgG/~(18)F-FDG在雷帕霉素處理的同種移植模型中顯像價值的評價47-59
• 前言47-49
• 材料和方法49-54
• 一、實驗材料49-50
• 二、實驗儀器50-51
• 三、實驗方法51-54
• 1. 建立小鼠同種異體皮膚移植模型51
• 2. 同種移植模型分組51
• 3. Iodogen法制備~(131)I碘化標記TLR5及對照同種型IgG51-52
• 4. ~(131)I-IgG在同種移植模型中的體內生物學分布52
• 5. ~(131)I-anti-TLR5 mAb在同種移植模型中動態(tài)全身磷屏自顯影顯像分析52
• 6. ~(131)I-IgG在同種移植模型中的動態(tài)全身磷屏自顯影顯像分析52-53
• 7. ~(18)F-FDG在同種移植模型中的動態(tài)全身磷屏自顯影顯像分析53
• 8. 統(tǒng)計學分析53-54
• 實驗結果54-56
• 一、~(131)I-anti-TLR5 mAb制備54
• 二、~(131)I-IgG制備和體外穩(wěn)定性54
• 1. ~(131)I-IgG的放射性碘化標記結果54
• 2. 體外穩(wěn)定性54
• 三、~(131)I-IgG在雷帕霉素治療的同種移植模型中的體內生物學分布54
• 四、~(131)I-IgG在同種移植模型中的動態(tài)全身磷屏自顯影顯像分析54-55
• 1. 雷帕霉素治療組54
• 2. 排斥對照組54-55
• 五、~(18)F-FDG在同種移植模型中的動態(tài)全身磷屏自顯影顯像分析55
• 1. 雷帕霉素治療組55
• 2. 排斥對照組55
• 六、動態(tài)全身磷屏自顯影顯像半定量分析55-56
• 討論56-59
• 第三部分 同種移植排斥過程中自噬分子的表達及意義59-77
• 前言59-62
• 材料與方法62-71
• 一、實驗材料62-66
• 二、實驗儀器66-67
• 三、實驗方法67-71
• 1. 小鼠同種皮膚移植模型的建立67
• 2. 受體小鼠脾細胞提取67
• 3. 移植皮膚和受體脾細胞RNA的提取67-68
• 4. cDNA的合成68-69
• 5. 熒光實時定量PCR69
• 6. 移植皮膚和受體脾細胞總蛋白的提取69-70
• 7. SDS-PAGE電泳70-71
• 8. 同種移植排斥過程中移植皮膚部位TLR5的表達與自噬發(fā)生水平的相關性分析71
• 9. 統(tǒng)計學分析71
• 實驗結果71-74
• 一、熒光實時定量PCR測定自噬相關基因Beclin1和Atg5的表達71-72
• 1. Beclin1在同種移植和雷帕霉素治療組模型脾細胞的表達71-72
• 2. Atg5在同種移植和雷帕霉素治療組模型脾細胞的表達72
• 3. Beclin1在同種移植和雷帕霉素治療組模型皮膚的表達72
• 4. Atg5在同種移植和雷帕霉素治療組模型皮膚的表達72
• 二、熒光實時定量PCR測定自噬相關蛋白Beclin1、Atg5、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表達72-73
• 1. 在同種移植模型和雷帕霉素治療組模型脾細胞的表達72-73
• 2. 在同種移植模型和雷帕霉素治療組模型移植皮膚部位的表達73
• 三.同種移植排斥過程中移植皮膚部位TLR5的表達與自噬發(fā)生水平的相關性分析73-74
• 討論74-77
• 全文小結77-78
• 論文創(chuàng)新點78-79
• 附圖表79-98
• 參考文獻98-107
• 致謝107-108
• 攻讀碩博研究生期間發(fā)表的學術論文目錄108-109
• 攻讀碩博研究生期間參與科研項目情況109-110
• 攻讀碩博研究生期間獲得獎勵情況110-111
• 已發(fā)表SCI論文111-150
• Paper One111-132
• Paper Two132-150
• 學位論文評閱及答辯情況表150

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前1條

1 鄭永先;侯桂華;宋靜;張超;梁婷;;雷帕霉素對同種移植耐受模型CD4~+CD25~+ T細胞活性的影響[J];細胞與分子免疫學雜志;2007年04期

，

本文編號：767477