本文關(guān)鍵詞：BKCa表達(dá)調(diào)節(jié)對前列腺癌生長和轉(zhuǎn)移的影響及其分子機(jī)制

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【摘要】：前列腺癌是男性常見的惡性腫瘤。2012年全世界前列腺癌新確診病例110萬,位居各瘤種第二位。在發(fā)達(dá)國家前列腺癌新發(fā)病例位居各瘤種首位,在發(fā)展中國家位居第4位。隨著中國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人口老齡化和人們生活方式的改變,前列腺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢。目前,前列腺癌篩查、早期診斷、手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌和免疫治療等綜合診療模式使患者的死亡率逐漸降低,但仍有相當(dāng)一部分患者會出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此,需要不斷探索前列腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,尋找潛在的干預(yù)靶點(diǎn)。近年來研究發(fā)現(xiàn),離子通道在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。臨床上大約有13%的藥物都作用于離子通道,用于治療心血管和神經(jīng)系統(tǒng)異常等多種疾病。因此,探索將離子通道作為某些腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)或預(yù)測指標(biāo)具有重要的研究意義。BKCa是廣泛表達(dá)于心肌、血管平滑肌、神經(jīng)系統(tǒng)等全身多種組織和器官的大電導(dǎo)鈣激活鉀通道。BKCa在可興奮細(xì)胞中主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜電位和細(xì)胞內(nèi)鈣信號,參與調(diào)控血管舒縮性和神經(jīng)興奮性等生理功能。近年來研究發(fā)現(xiàn),BKCa在多種腫瘤中呈高表達(dá)并參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲等許多惡性生物學(xué)行為。BKCa的編碼基因在晚期前列腺癌中的擴(kuò)增率達(dá)16%,而在早期患者中無擴(kuò)增。目前研究發(fā)現(xiàn),BKCa可以促進(jìn)前列腺癌的增殖,但其分子機(jī)制尚未完全闡明。此外,除細(xì)胞增殖外BKCa是否也參與了前列腺癌的轉(zhuǎn)移、BKCa在體外的促腫瘤作用是否也能在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)這些問題均有待回答。本課題從前列腺癌細(xì)胞系、荷瘤裸鼠體內(nèi)和臨床腫瘤組織和三個(gè)層面檢測了BKCa的表達(dá)和功能,初步探討了BKCa表達(dá)調(diào)節(jié)對前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、體內(nèi)成瘤和轉(zhuǎn)移的影響及其分子機(jī)制。第一部分BKCa在前列腺癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)目的:比較BKCa在前列腺癌細(xì)胞和組織與正常細(xì)胞和癌旁良性組織中的表達(dá)差異,分析BKCa表達(dá)與前列腺癌臨床分期和腫瘤增殖標(biāo)志物Ki67的相關(guān)性。方法:采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot和細(xì)胞免疫熒光檢測BKCa在前列腺癌細(xì)胞PC3和C4-2和正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1中的表達(dá)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot和免疫組織化學(xué)法檢測了前列腺癌組織與癌旁良性組織中BKCa的表達(dá)差異。采用免疫組織化學(xué)法檢測了前列腺癌組織中BKCa的表達(dá)與腫瘤分期和Ki67表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果:定量PCR和Western blot結(jié)果顯示BKCa的mRNA和蛋白質(zhì)在前列腺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)均高于癌旁良性組織和正常前列腺上皮細(xì)胞系。免疫組化結(jié)果提示,BKCa在前列腺癌組織中的表達(dá)與增殖標(biāo)志物Ki67呈正相關(guān)(r=0.461,p=0.0032),且BKCa的表達(dá)隨著前列腺癌分期的提高而增加,IV期前列腺癌中BKCa的表達(dá)明顯高于I-III期。結(jié)論:BKCa在前列腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于癌旁良性組織和正常上皮細(xì)胞,前列腺癌組織中BKCa與Ki67的表達(dá)呈正相關(guān),且腫瘤分期越晚BKCa表達(dá)越高。第二部分BKCa表達(dá)調(diào)節(jié)對前列腺癌生長和轉(zhuǎn)移的影響目的:探討B(tài)KCa表達(dá)調(diào)節(jié)對前列腺癌生長和轉(zhuǎn)移的影響方法:通過質(zhì)粒載體介導(dǎo)的BKCa上調(diào)體系和慢病毒載體介導(dǎo)的BKCa穩(wěn)定沉默體系實(shí)現(xiàn)對前列腺癌PC3和C4-2細(xì)胞系中BKCa表達(dá)的上、下調(diào),并采用MTT、EdU、平板克隆、細(xì)胞劃痕、Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測BKCa表達(dá)上、下調(diào)對細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。采用前列腺癌PC3細(xì)胞構(gòu)建裸鼠皮下種植瘤模型和細(xì)胞尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移模型,檢測BKCa表達(dá)下調(diào)對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響及腫瘤組織中Ki67的表達(dá)變化。結(jié)果:BKCa表達(dá)上調(diào)后,前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞活力、DNA合成效率和克隆形成能力較對照組明顯提高,細(xì)胞劃痕愈合率、遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)量也較對照組顯著提高;BKCa表達(dá)下調(diào)則會抑制前列腺癌細(xì)胞的上述生物學(xué)行為。體內(nèi)研究顯示,BKCa表達(dá)下調(diào)后PC3細(xì)胞裸鼠種植瘤體積、質(zhì)量和Ki67表達(dá)較對照組明顯降低,尾靜脈注射的PC3細(xì)胞肺臟轉(zhuǎn)移數(shù)目明顯減少。結(jié)論:BKCa表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力;BKCa表達(dá)下調(diào)則會抑制前列腺癌細(xì)胞的上述生物學(xué)行為,并抑制腫瘤在裸鼠體內(nèi)生長和轉(zhuǎn)移。第三部分BKCa調(diào)控前列腺癌生長和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制目的:探討B(tài)KCa調(diào)控前列腺癌生長和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制方法:采用膜片鉗技術(shù)驗(yàn)證BKCa激動劑NS1619和抑制劑IBTX對PC3細(xì)胞鉀電流的作用,并檢測BKCa活性調(diào)節(jié)對前列腺癌增殖和遷移的影響。采用激光共聚焦免疫熒光和免疫共沉淀技術(shù)檢測BKCa與整合素αvβ3和FAK的共定位和相互作用情況,通過Western blot檢測BKCa表達(dá)調(diào)節(jié)對整合素αvβ3、FAK和p-FAK(Tyr397)表達(dá)的影響。采用整合素αvβ3封閉抗體LM609和FAK抑制劑Y15處理BKCa表達(dá)上調(diào)的PC3細(xì)胞,檢測細(xì)胞增殖和遷移變化,驗(yàn)證整合素αvβ3/FAK通路在BKCa調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞增殖和遷移中發(fā)揮的作用。采用免疫熒光技術(shù)檢測臨床前列腺癌標(biāo)本中的BKCa和p-FAK(Tyr397)表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果:BKCa的離子通透功能在促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖和遷移中發(fā)揮一定作用但并非主要機(jī)制。BKCa與整合素αvβ3和FAK存在共定位和相互作用,BKCa表達(dá)調(diào)節(jié)對整合素αvβ3和FAK的表達(dá)無影響,但可通過與整合素αvβ3和FAK形成功能復(fù)合體,加強(qiáng)后兩者間的信號偶聯(lián)從而增加FAK的磷酸化,最終促進(jìn)PC3細(xì)胞的增殖和遷移。阻斷αvβ3/FAK信號通路后可明顯削弱BKCa表達(dá)上調(diào)對細(xì)胞增殖和遷移的促進(jìn)作用。在臨床前列腺癌標(biāo)本中,BKCa和p-FAK(Tyr397)的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.517,p=0.0008)。結(jié)論:BKCa通過與FAK和整合素αvβ3形成功能復(fù)合體并加強(qiáng)后兩者之間的信號偶聯(lián)促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。
【關(guān)鍵詞】：BKCa 整合素αvβ3 FAK 前列腺癌 增殖 遷移 侵襲 轉(zhuǎn)移 裸鼠
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.25
【目錄】：

• 縮略語表6-9
• 中文摘要9-13
• 英文摘要13-18
• 前言18-20
• 文獻(xiàn)回顧20-55
• 第一部分 前列腺癌研究現(xiàn)狀20-34
• 第二部分 鉀離子通道在腫瘤中的表達(dá)和作用34-45
• 第三部分BKCa在腫瘤中的研究進(jìn)展45-55
• 第一部分 BKCa在前列腺癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)55-69
• 1 材料55-57
• 1.1 細(xì)胞系55
• 1.2 前列腺癌組織55
• 1.3 儀器設(shè)備55-56
• 1.4 主要試劑56-57
• 2 方法57-63
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)57
• 2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR57-59
• 2.3 Western blot59-61
• 2.4 免疫組織化學(xué)61-62
• 2.5 免疫熒光62-63
• 2.6 統(tǒng)計(jì)分析63
• 3 結(jié)果63-67
• 3.1 BKCa在前列腺癌細(xì)胞和正常細(xì)胞系中的表達(dá)差異63-64
• 3.2 BKCa在前列腺癌和癌旁良性組織中的表達(dá)差異64-65
• 3.3 BKCa在前列腺癌組織中的表達(dá)與Ki67 的相關(guān)性65-66
• 3.4 BKCa在前列腺癌組織中的表達(dá)與腫瘤分期的關(guān)系66-67
• 4 討論67-69
• 第二部分 BKCa表達(dá)調(diào)節(jié)對前列腺癌生長和轉(zhuǎn)移的影響69-85
• 1 材料69-70
• 1.1 病毒和質(zhì)粒69
• 1.2 儀器設(shè)備69
• 1.3 主要試劑69-70
• 2 方法70-75
• 2.1 重組質(zhì)粒p IRES-BKCa的轉(zhuǎn)染70-71
• 2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染71
• 2.3 MTT實(shí)驗(yàn)71
• 2.4 Ed U實(shí)驗(yàn)71-72
• 2.5 平板克隆實(shí)驗(yàn)72
• 2.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)72-73
• 2.7 Transwell實(shí)驗(yàn)73-74
• 2.8 荷瘤裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)74
• 2.9 統(tǒng)計(jì)分析74-75
• 3 結(jié)果75-82
• 3.1 BKCa表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖75-76
• 3.2 BKCa表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲76-77
• 3.3 慢病毒介導(dǎo)的BKCa-sh RNA下調(diào)效果驗(yàn)證77-78
• 3.4 BKCa表達(dá)下調(diào)可抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖78-80
• 3.5 BKCa表達(dá)下調(diào)可抑制前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲80-81
• 3.6 BKCa表達(dá)下調(diào)可抑制前列腺癌裸鼠體內(nèi)生長和轉(zhuǎn)移81-82
• 4 討論82-85
• 第三部分 BKCa調(diào)控前列腺癌生長和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制85-99
• 1 材料85-86
• 1.1 細(xì)胞系85
• 1.2 儀器設(shè)備85
• 1.3 主要試劑85-86
• 2 方法86-88
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)86
• 2.2 激光共聚焦檢測86
• 2.3 免疫共沉淀86-87
• 2.4 膜片鉗實(shí)驗(yàn)87-88
• 2.5 MTT實(shí)驗(yàn)88
• 2.6 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)88
• 2.7 統(tǒng)計(jì)分析88
• 3 結(jié)果88-94
• 3.1 BKCa的離子通透功能在其促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖和遷移中的作用88-90
• 3.2 BKCa與整合素 αvβ3 在前列腺癌PC3 細(xì)胞中的共表達(dá)和定位90-91
• 3.3 BKCa通過募集FAK至整合素 αvβ3 促進(jìn)其磷酸化91-92
• 3.4 阻斷FAK信號通路可消除BKCa對細(xì)胞增殖和遷移的促進(jìn)作用92-94
• 3.5 BKCa和p-FAK在臨床前列腺癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)94
• 4 討論94-99
• 小結(jié)99-100
• 參考文獻(xiàn)100-121
• 個(gè)人簡歷和研究成果121-122
• 致謝122

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本文編號：736944