本文關(guān)鍵詞：胎盤(pán)生長(zhǎng)因子調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在宮頸癌轉(zhuǎn)移中的作用研究

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【摘要】：研究背景宮頸癌是嚴(yán)重危害女性健康的重大惡性疾病,發(fā)病率為女性惡性腫瘤的第三位,僅次于乳腺癌和肺癌,也是導(dǎo)致女性死亡的第二大病因。我國(guó)是宮頸癌的高發(fā)地區(qū),有資料顯示,我國(guó)每年有近13.1萬(wàn)例新發(fā)宮頸癌患者,近80%確診時(shí)已有浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移,每年有超過(guò)5萬(wàn)例患者因?qū)m頸癌而死亡。目前,宮頸癌的治療主要依賴手術(shù)及放化療的綜合治療手段,雖然治療效果較為確切,但是復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)仍然很高。研究報(bào)道,盡管經(jīng)過(guò)規(guī)范化的治療,宮頸癌的復(fù)發(fā)率占35%,且近90%是在初次治療后的3年內(nèi)復(fù)發(fā),而復(fù)發(fā)后的宮頸癌的轉(zhuǎn)移仍然是治療中遇到的最為棘手的問(wèn)題,也是導(dǎo)致宮頸癌治療失敗及患者死亡的重要原因。同時(shí),對(duì)于晚期宮頸癌患者,目前療效仍缺乏確切的治療手段。高危人乳頭瘤病毒(HPV)持續(xù)性感染已確認(rèn)是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的最主要原因。近年來(lái),隨著宮頸癌篩查手段的不斷進(jìn)步以及HPV預(yù)防性疫苗的應(yīng)用,發(fā)達(dá)國(guó)家的宮頸癌發(fā)生率和死亡率均有明顯的下降。盡管已有針對(duì)HPV的預(yù)防性疫苗及可靠的宮頸癌篩查手段,但目前宮頸癌的發(fā)病仍然呈上升的趨勢(shì),因此,進(jìn)一步認(rèn)識(shí)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,了解其浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的機(jī)制,仍然是發(fā)展有效治療策略的重要措施。宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致其治療失敗及患者死亡的重要原因。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的第一步,也是導(dǎo)致宮頸癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的重要原因。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是上皮細(xì)胞失去其表面標(biāo)記,逐漸轉(zhuǎn)化為具有活動(dòng)能力的間質(zhì)細(xì)胞,并失去其表面標(biāo)記,獲得具有浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移能力的過(guò)程,其表現(xiàn)為上皮細(xì)胞特征性的表面標(biāo)記表達(dá)E-cadherin表達(dá)下調(diào),而間質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)記如vimentin上調(diào),同時(shí),出現(xiàn)細(xì)胞活動(dòng)能力增加,與周圍組織的粘附能力下降,使細(xì)胞獲得向遠(yuǎn)處組織浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的能力。大量研究證實(shí),EMT除了在胚胎發(fā)育及器官發(fā)生、創(chuàng)傷修復(fù)及組織重建、器官纖維化、慢性炎癥等中發(fā)揮作用外,在腫瘤干細(xì)胞形成及腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著極為重要的作用。有趣的是,在EMT在腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程中,呈現(xiàn)一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程:EMT能夠促進(jìn)腫瘤的局部浸潤(rùn),但是腫瘤向遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移過(guò)程中,首先需要形成間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化(Mesenchymal-Epithelial Transition,MET),進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)閑mt,從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移。這種可逆的變化表明emt不是受到遺傳或者表觀遺傳學(xué)的調(diào)控,而是受來(lái)自于腫瘤微環(huán)境(tumormicroenvironment,tme)中的各種相關(guān)因素調(diào)控的。而emt在宮頸癌的轉(zhuǎn)移中同樣發(fā)揮著重要的作用,研究發(fā)現(xiàn),hpv感染、致癌基因激活及腫瘤微環(huán)境的改變均可以導(dǎo)致宮頸癌emt的發(fā)生。而hpv感染引起的宮頸微環(huán)境的改變可能在這一過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。腫瘤微環(huán)境(tme)是腫瘤細(xì)胞賴以生存的外部條件,由成纖維細(xì)胞,免疫細(xì)胞,細(xì)胞外基質(zhì)及由其分泌的各種細(xì)胞因子成分等構(gòu)成。研究認(rèn)為腫瘤微環(huán)境在抑制腫瘤免疫,提高腫瘤耐藥、促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移方面起著重要的作用,腫瘤局部微環(huán)境為腫瘤的發(fā)展提供了一個(gè)適宜的局部環(huán)境,為腫瘤的進(jìn)展轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)耐藥,提供滋生的良好環(huán)境。腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子,如腫瘤壞死因子(tnf-α),白細(xì)胞介素(il-1,6,8),轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(tgfβ),血管生成因子(vegfplgf)以及一些非腫瘤細(xì)胞,包括巨噬細(xì)胞,淋巴細(xì)胞等,均在促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)進(jìn)展方面發(fā)揮著重要的作用。hpv感染是導(dǎo)致宮頸癌的重要原因,也是導(dǎo)致宮頸局部微環(huán)境改變的重要因素,hpv持續(xù)感染導(dǎo)致宮頸局部持續(xù)的炎癥狀態(tài),誘導(dǎo)并激活多種炎癥細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子及化學(xué)成分,形成一個(gè)復(fù)雜的宮頸陰道微環(huán)境,在促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中,發(fā)揮著重要的作用。hpv感染后,引起宮頸上皮惡性轉(zhuǎn)化,是一個(gè)漸進(jìn)發(fā)展的過(guò)程,而emt是導(dǎo)致轉(zhuǎn)化宮頸上皮進(jìn)展為侵襲性腫瘤的重要因素。宮頸癌是由宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervicalintraepithelialneoplasia,cin)細(xì)胞向具有侵襲轉(zhuǎn)移能力的惡性細(xì)胞逐漸發(fā)展而來(lái),某些cin病變,有可能逆轉(zhuǎn)為正常宮頸上皮,這一可逆性的改變與emt類似,提示emt和cin存在某種聯(lián)系,可能都是受到宮頸微環(huán)境所調(diào)控的。而hpv感染是宮頸癌的主要元兇,也是導(dǎo)致宮頸微環(huán)境改變的最重要因素。hpv感染可能通過(guò)改變宮頸局部微環(huán)境進(jìn)而促進(jìn)宮頸癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn),胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(placentagrowthfactor,plgf)在肺癌及乳腺癌中的表達(dá)明顯上調(diào),同時(shí),通過(guò)激活plgf特異性受體flt-1可以促進(jìn)某些腫瘤發(fā)生emt。已有研究證實(shí)了hpv感染導(dǎo)致宮頸微環(huán)境改變,誘導(dǎo)各種炎癥細(xì)胞聚集和炎癥介質(zhì)的釋放,這其中包括plgf,這些變化可能進(jìn)一步促進(jìn)了已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)化的瘤變上皮向浸潤(rùn)癌的發(fā)展。同時(shí),hpv感染后的宮頸上皮組織中,可以檢測(cè)到plgf的mrna表達(dá)明顯上調(diào);而在宮頸癌組織中,研究發(fā)現(xiàn),plgf及其mrna的表達(dá)水平均明顯高于癌旁組織。因此,plgf作為hpv感染后,宮頸微環(huán)境中的重要成分,在腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(plgf)是血管生成因子家族(vegf)家族的成員之一,與其他血管生成因子家族不同的是,plgf在正常生理狀態(tài)下幾乎不表達(dá)或表達(dá)量極低,而在缺血、炎癥及腫瘤等病理狀態(tài)下,其表達(dá)量明顯上調(diào),提示plgf可能作為疾病狀態(tài)下的重要生物學(xué)標(biāo)記或疾病預(yù)后的重要生物學(xué)監(jiān)測(cè)指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn),plgf作為一種多功能的細(xì)胞因子,可能通過(guò)多種方式促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展,包括1.促進(jìn)腫瘤血管形成2.促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖3.誘導(dǎo)形成腫瘤局部免疫耐受狀態(tài)等.因此認(rèn)為plgf可能作為預(yù)測(cè)腫瘤嚴(yán)重程度及預(yù)后的機(jī)具價(jià)值的生物學(xué)標(biāo)記。flt-1作為plgf的特異性受體,在plgf的功能發(fā)揮上,具有重要的意義,有研究發(fā)現(xiàn),plgf只對(duì)表達(dá)flt-1受體的腫瘤具有促進(jìn)浸潤(rùn)遷移的作用,而對(duì)于不表達(dá)flt-1的腫瘤細(xì)胞不具有功能。在局部缺血及炎癥性疾病以及許多腫瘤包括非小細(xì)胞肺癌(nsclc),前列腺癌,乳腺癌和結(jié)腸癌,肺腺癌,肝細(xì)胞癌,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤,多發(fā)性骨髓瘤和腎母細(xì)胞瘤中,均可以觀察到plgf及其受體flt-1表達(dá)的上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn),plgf可以通過(guò)激活emt信號(hào)促進(jìn)包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。而在宮頸癌的研究中,研究報(bào)道證實(shí)plgf在宮頸癌組織中明顯高表達(dá),但是plgf在宮頸癌中的作用及機(jī)制,未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此,闡明plgf在宮頸癌中的作用及其機(jī)制,為進(jìn)一步深入理解宮頸癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的機(jī)制,開(kāi)發(fā)新的宮頸癌篩查手段及治療策略均具有重要的意義。研究目的通過(guò)檢測(cè)plgf及其受體flt-1及emt相關(guān)蛋白e-cadherin、vimentin在宮頸癌及癌旁正常宮頸組織中的表達(dá)特點(diǎn),分析研究各蛋白表達(dá)與宮頸癌分期、分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性;同時(shí),檢測(cè)了宮頸癌患者血清及陰道盥洗液中plgf的表達(dá)水平與宮頸癌分期及hpv感染狀態(tài)之間的相關(guān)性。采用培養(yǎng)的宮頸癌siha細(xì)胞系,研究plgf對(duì)宮頸癌細(xì)胞的促遷移作用及對(duì)emt相關(guān)蛋白的表達(dá)調(diào)控作用及其可能機(jī)制。為進(jìn)一步了解宮頸癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移機(jī)制,開(kāi)發(fā)新的宮頸癌篩查手段及治療策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究方法1.采用he染色技術(shù),確認(rèn)所收集的組織標(biāo)本取材的準(zhǔn)確性,對(duì)所取得的準(zhǔn)確的標(biāo)本納入后續(xù)的研究。2.采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù),檢測(cè)plgf、受體flt-1及emt相關(guān)蛋白e-cadherin及vimentin,在宮頸癌及癌旁組織的表達(dá)情況,并分析它們之間的相關(guān)性。3.采用westernblot技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)宮頸癌及癌旁正常組織中,plgf、受體flt-1及emt相關(guān)蛋白e-cadherin及vimentin,在宮頸癌及癌旁組織的表達(dá)情況。4.采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(elisa)法檢測(cè)宮頸癌患者及正常對(duì)照人群血清及陰道盥洗液中,分析plgf的表達(dá)水平與hpv感染狀態(tài)及腫瘤分期之間的關(guān)系。5.采用體外培養(yǎng)的宮頸癌siha細(xì)胞系,應(yīng)用transwell法,分析研究plgf刺激對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移作用。6.采用westernblot方法,分析plgf處理后的siha細(xì)胞中,emt相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。7.采用shrna-flt-1慢病毒載體感染siha細(xì)胞,用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)shrna-flt-1的細(xì)胞株。8.采用正常培養(yǎng)的siha細(xì)胞及穩(wěn)定沉默flt-1的siha細(xì)胞,并應(yīng)用transwell法及westernblot技術(shù),分析研究敲除flt-1后,plgf對(duì)siha細(xì)胞促進(jìn)遷移作用及emt相關(guān)蛋白表達(dá)情況的影響。9.采用培養(yǎng)的正常siha細(xì)胞,預(yù)先給予erk/mapk信號(hào)通路抑制劑處理后,采用transwell及westernblot技術(shù),觀察分析erk/mapk信號(hào)被抑制后,plgf對(duì)siha細(xì)胞促進(jìn)遷移作用及emt相關(guān)蛋白表達(dá)情況的影響。結(jié)果1.在110例宮頸癌組織標(biāo)本中,plgf及其受體flt-1的表達(dá)明顯高于對(duì)應(yīng)的癌旁對(duì)照組織,它們表達(dá)的陽(yáng)性率分別為61.8%和60.9%;而e-cadherin的表達(dá)明顯降低占61.8%,vimentin呈高表達(dá)陽(yáng)性率為59.1%。相關(guān)性分析表明,plgf及flt-1在宮頸癌組織中的高表達(dá)與e-cadherin的低表達(dá)及vimentin的表達(dá)上調(diào)密切相關(guān)(p0.01,r=-0.618;p0.01,r=0.450);westernblot檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí),plgf、flt-1及vimentin在宮頸癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁對(duì)照組織,而e-cadherin的表達(dá)則明顯低于癌旁組織。2.宮頸癌患者血清plgf的水平明顯高于正常對(duì)照組(22.96±0.90ng/mlvs9.926±1.049ng/m,p0.001),且隨著腫瘤分期的進(jìn)展而升高(p0.001);在陰道盥洗液中,患者plgf的表達(dá)水平也明顯高于對(duì)照組(24.80±0.73ng/mlvs11.29±0.90ng/ml,p0.001);而血清及陰道盥洗液之間或?qū)m頸癌i期和ii期患者之間,plgf的表達(dá)無(wú)明顯差異(p0.05)。3.hpv感染陽(yáng)性患者陰道盥洗液中plgf的表達(dá)水平明顯高于hpv感染陰性組(25.74±0.6258ng/mlvs11.40±0.7439ng/ml,p0.05)。4.體外實(shí)驗(yàn)證實(shí):plgf處理后的siha細(xì)胞的遷移率明顯上調(diào),而采用shrna-flt-1沉默flt-1的表達(dá)后,可以明顯下調(diào)siha細(xì)胞的遷移(p0.05),同時(shí),plgf可以明顯下調(diào)e-cadherin的表達(dá)并上調(diào)vimentin的表達(dá),但沉默flt-1的表達(dá)后,可以逆轉(zhuǎn)上述蛋白的表達(dá)。5.ERK/MAPK信號(hào)通路抑制劑PD98059處理siha細(xì)胞后,能夠明顯抑制PLGF對(duì)siha細(xì)胞的促進(jìn)遷移作用,并能夠抑制PLGF對(duì)siha細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的調(diào)控作用。結(jié)論1.PLGF及其受體Flt-1在宮頸癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁對(duì)照組織,且與EMT相關(guān)蛋白E-cadherin在宮頸癌組織的低表達(dá)及vimentin的高表達(dá)密切相關(guān),提示PLGF可能通過(guò)調(diào)控EMT相關(guān)蛋白的表達(dá),發(fā)揮促進(jìn)宮頸癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的作用,因此,追蹤PLGF的表達(dá)變化有可能為預(yù)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)提供預(yù)警。2.PLGF在宮頸癌患者血清及陰道盥洗液中的含量明顯高于正常對(duì)照組,且與宮頸癌分期密切相關(guān);而HPV感染患者陰道盥洗液中PLGF的表達(dá)水平明顯高于HPV陰性人群,提示HPV感染可能是促進(jìn)PLGF表達(dá)升高的重要因素,因此,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)陰道分泌物中PLGF的表達(dá)變化,可能為HPV感染導(dǎo)致宮頸癌提供佐證,而PLGF有可能成為新的宮頸癌篩查標(biāo)記。3.PLGF通過(guò)激活其受體Flt-1促進(jìn)宮頸癌siha細(xì)胞的遷移及調(diào)控EMT相關(guān)蛋白的表達(dá);抑制ERK/MAPK信號(hào)通路能夠抑制PLGF的上述功能,提示PLGF/Flt-1/ERK/MAPK通路在促進(jìn)宮頸癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中,發(fā)揮著重要的作用,有望為臨床抑制宮頸癌轉(zhuǎn)移提供新的藥物研究靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：胎盤(pán)生長(zhǎng)因子 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 腫瘤微環(huán)境 腫瘤轉(zhuǎn)移
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.33
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-7
• 英文摘要7-13
• 中文摘要13-18
• 第一章 前言18-26
• 第二章 宮頸癌組織中PLGF及其受體Flt-1 的表達(dá)與EMT相關(guān)蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性研究26-43
• 2.1 材料與方法26-30
• 2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析30
• 2.3 結(jié)果30-40
• 2.4 討論40-43
• 第三章 PLGF在宮頸癌患者外周血及陰道盥洗液中的表達(dá)及其與宮頸癌分期之間的關(guān)系43-52
• 3.1 材料及方法43-45
• 3.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析45
• 3.3 結(jié)果45-49
• 3.4 討論49-52
• 第四章 PLGF通過(guò)激活Flt-1 信號(hào)通路促進(jìn)宮頸癌siha細(xì)胞的遷移及調(diào)控EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)52-67
• 4.1 材料與方法53-56
• 4.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析56
• 4.3 結(jié)果56-63
• 4.4 討論63-67
• 第五章 PLGF/Flt-1 通過(guò)激活ERK/MAPK信號(hào)通路促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞遷移及調(diào)控EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)67-75
• 5.1 材料及方法67-69
• 5.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析69-70
• 5.3 結(jié)果70-73
• 5.4 討論73-75
• 全文總結(jié)75-76
• 參考文獻(xiàn)76-86
• 文獻(xiàn)綜述 胎盤(pán)生長(zhǎng)因子在腫瘤中的作用及機(jī)制研究進(jìn)展86-105
• 參考文獻(xiàn)97-105
• 攻讀學(xué)位期間的成果105-106
• 致謝106-107

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本文編號(hào)：734441