發(fā)布時(shí)間：2017-08-17 12:33

  本文關(guān)鍵詞：干擾素-γ及自噬相關(guān)基因ATG5缺陷對(duì)APC突變所致腸道腫瘤的影響

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【摘要】：研究背景結(jié)腸癌嚴(yán)重威脅人類健康。在西方國(guó)家,結(jié)腸癌成為第二高發(fā)癌癥,并且,其發(fā)病率和死亡率逐年上升。結(jié)腸癌的發(fā)生與發(fā)展是一個(gè)多階段,由多基因參與的分子病理學(xué)過程。臨床上,約85%的散發(fā)性結(jié)腸癌病人攜帶有腺瘤息肉病基因(adenomatous polyposis coli, APC)的突變,APC基因突變?cè)谠缙诳蓪?dǎo)致結(jié)直腸腺瘤,而大部分結(jié)腸癌源于結(jié)腸腺瘤,腺瘤癌變一般需要十幾年時(shí)間。干擾素-γ(Interferon-gamma, IFN-γ)作為一種具有抗癌活性的內(nèi)源蛋白質(zhì),受到人們廣泛關(guān)注。除了重要的抗腫瘤作用外,IFN-γ還具有抗病毒、抗微生物、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、凋亡與分化和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等多種生物學(xué)功能。最近的研究報(bào)道,IFN-γ及其受體基因的突變與結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及其預(yù)后有著密切的聯(lián)系。然而,關(guān)于IFN-γ及其受體在結(jié)直腸癌發(fā)病過程中的作用及意義尚不明確。本論文第一部分借助經(jīng)典的APC突變所致腸道腫瘤模型(ApcMin/+小鼠模型)以及APC基因突變背景的人源結(jié)腸癌細(xì)胞,探討了干擾素-γ及其受體基因突變對(duì)APC突變誘發(fā)的腸道腫瘤發(fā)生和發(fā)展的影響,并對(duì)相關(guān)機(jī)制做了深入研究。細(xì)胞自噬是細(xì)胞對(duì)內(nèi)外壓力的一種適應(yīng)性反應(yīng),細(xì)胞吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器,形成自噬溶酶體,降解所包裹的內(nèi)容物,藉此促進(jìn)細(xì)胞的存活和恢復(fù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。自噬相關(guān)基因-5(autophagy related gene-5, ATG5)是自噬過程中一種重要的ATG基因,參與早期自噬體的形成,在細(xì)胞自噬過程起到了重要的作用。ATG5蛋白在正常結(jié)腸細(xì)胞中有表達(dá),而在23%的結(jié)直腸癌患者中發(fā)生缺失。盡管發(fā)病率較低,但ATG5基因缺陷可能在結(jié)腸癌的發(fā)病過程中起了重要作用。此外,體外研究表明,ATG5基因經(jīng)小干擾RNAs (small interfering RNAs, siRNAs)沉默后可以大大增強(qiáng)化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用。在第二部分,我們利用ApcMin/+小鼠模型和APC基因突變背景的人源結(jié)腸癌細(xì)胞,探討了ATG5基因缺陷對(duì)APC突變誘發(fā)的腸道腫瘤發(fā)生和發(fā)展的影響,并通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明了ATG5基因缺陷可以增強(qiáng)化療藥物對(duì)腫瘤的敏感性。第一部分IFN-y基因缺陷對(duì)APC突變誘發(fā)的腸道腫瘤的影響第一節(jié)內(nèi)源性IFN-y基因缺陷對(duì)ApcMin/+小鼠腸道腫瘤的影響實(shí)驗(yàn)?zāi)康模禾接憙?nèi)源性IFN-γ基因缺陷對(duì)ApcMin/+小鼠腸道腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響。實(shí)驗(yàn)方法：選用經(jīng)典的腸道腺瘤模型ApcMin/+小鼠模型以及IFN-γ基因缺陷的小鼠IFN-γ-/-或IFN-γ+/-小鼠,通過雜交繁育和基因鑒定等方法得到子代雙基因缺陷的ApcMin/+IFN-γ+/-小鼠。通過比較子代ApcMin/+IFN-γ+/+小鼠與ApcMin/+IFN-γ+/"小鼠腸道腺瘤大小和數(shù)目,確定IFN-γ缺陷對(duì)ApcMin/+小鼠腸道腫瘤的影響；通過組織病理學(xué)檢查得出IFN-γ缺陷對(duì)ApcMin/+小鼠腸道腫瘤惡性程度的影響；ELISA法檢測(cè)IFN-γ基因缺陷對(duì)小鼠血清IFN-γ水平的影響；免疫組化法檢測(cè)IFN-γ缺陷對(duì)腸道腫瘤微環(huán)境中免疫因子數(shù)量和分布的調(diào)節(jié)作用；進(jìn)一步對(duì)腸道腫瘤進(jìn)行western blotting分析,檢測(cè)IFN-γ基因缺陷對(duì)腫瘤組織中IFN-γ信號(hào)通路、Wnt/β-catenin以及EGFR/Erk1/2等信號(hào)通路的調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：小鼠正常飼養(yǎng)至6月齡時(shí),大多數(shù)ApcMin/+IFN-γ+/+小鼠狀態(tài)良好,而接近半數(shù)的ApcMin/+IFN-γ+/-小鼠發(fā)生死亡,其余存活的ApcMin/+IFN-γ+/-小鼠狀態(tài)較差,大多出現(xiàn)便血或脫肛。解剖發(fā)現(xiàn),與ApcMin/+IFN-γ+/+小鼠相比,ApcMin/+IFN-γ+/-小鼠腸道腺瘤的大小和數(shù)目都有顯著的增加。組織病理學(xué)結(jié)果表明,41.7%的ApcMin/+IFN-γ+/-小鼠的腸道腺瘤發(fā)生了癌變。ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)雜合性的IFN-γ缺陷降低了小鼠血清中IFN-γ水平；免疫組化檢測(cè)結(jié)果表明,IFN-γ缺陷可以調(diào)節(jié)腸道腫瘤微環(huán)境中免疫因子CD4、CD8及F4/80的數(shù)量和分布,進(jìn)而限制了ApcMin/+小鼠的抗腫瘤細(xì)胞免疫能力。Western blotting實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),雜合性IFN-γ缺陷對(duì)IFN-γ信號(hào)通路具有一定的抑制作用,并且激活了腫瘤相關(guān)信號(hào)通路Wnt/β-catenin和EGFR/Erk1/2,促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。因此,IFN-γ缺陷可以促進(jìn)ApcMin/+小鼠腸道腫瘤的發(fā)展,并且可以促使良性的ApcMin/+小鼠腸道腺瘤發(fā)生癌變。這一作用可能與IFN-γ缺陷對(duì)Wnt/β-catenin和EGFR/Erk1/2等腫瘤相關(guān)信號(hào)通路的活化作用有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)論：IFN-γ在APC突變誘發(fā)的腸道腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中扮演了限速因子的角色,這個(gè)結(jié)果揭示了IFN-γ在癌癥生物學(xué)中的一個(gè)新的作用。第二節(jié)干擾素-γ受體基因缺陷對(duì)APC突變背景的人源結(jié)腸癌細(xì)胞株生長(zhǎng)的影響實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^體外試驗(yàn),檢測(cè)IFN-γ受體基因發(fā)生缺失對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。實(shí)驗(yàn)方法：使用轉(zhuǎn)染試劑lipofectamineTM 2000進(jìn)行小干擾RNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn),下調(diào)HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞中的IFNγR1基因水平；使用western blotting法檢測(cè)IFNγR1蛋白的表達(dá)水平,確定IFNγR1基因的沉默效率。通過MTT法檢測(cè)IFN-γ對(duì)HT-29細(xì)胞以及IFNγR1基因沉默的HT-29細(xì)胞的抑制作用,進(jìn)一步驗(yàn)證IFNγR1基因的沉默效果；通過MTT實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IFNγR1沉默對(duì)HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響；通過使用western blotting法檢測(cè)IFNγR1沉默對(duì)HT-29細(xì)胞中Wnt/β-catenin和EGFR/Erk1/2等腫瘤相關(guān)信號(hào)通路的影響。使用MTT法反方向驗(yàn)證外源性IFN-γ對(duì)HT-29和HCT-116結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用,通過western blotting法檢測(cè)IFN-γ抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：通過lipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染IFNγR1-target siRNA,下調(diào)了HT-29細(xì)胞中IFNγR1水平,western blotting試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),siRNA可以顯著降低HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞中的IFNγR1蛋白水平,沉默效率達(dá)70%以上。MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IFN-γ對(duì)IFNγR1沉默的HT-29細(xì)胞的抑制作用不敏感,從而進(jìn)一步證實(shí)了IFNγR1蛋白水平被有效下調(diào)。細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)得出,與沉默無(wú)關(guān)序列相比,沉默IFNγR1后HT-29細(xì)胞的克隆形成能力明顯增強(qiáng)。Western blotting結(jié)果顯示IFNγR1沉默顯著促進(jìn)了Wnt/β-catenin和EGFR/Erk1/2信號(hào)通路。進(jìn)一步MTT檢測(cè)結(jié)果表明,IFN-γ可顯著抑制APC突變背景的人源結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的增殖,抑制作用呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性,而IFN-γ對(duì)野生型APC基因背景的HCT-116人源結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖無(wú)明顯抑制作用。利用western blotting方法進(jìn)一步檢測(cè)了IFN-γ對(duì)HT-29細(xì)胞的作用機(jī)制,結(jié)果表明,IFN-γ刺激促進(jìn)了STAT1磷酸化,激活了HT-29細(xì)胞中的IFN-γ信號(hào)通路,并且,IFN-γ可抑制HT-29細(xì)胞中的Wnt/β-catenin信號(hào)通路,通過增加β-catenin的磷酸化進(jìn)而促進(jìn)β-catenin的降解。實(shí)驗(yàn)結(jié)論：IFN-γ可顯著抑制APC突變背景的人源結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的增殖,而對(duì)野生型APC基因背景的HCT-116人源結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖無(wú)顯著影響。沉默IFNγR1可促進(jìn)HT-29細(xì)胞的克隆形成,此作用可能與對(duì)腫瘤相關(guān)信號(hào)通路Wnt/β-catenin和EGFR/Erk1/2的調(diào)節(jié)作用相關(guān)。第二部分自噬相關(guān)基因ATG5缺陷對(duì)APC突變誘發(fā)的腸道腫瘤的影響第一節(jié)內(nèi)源性ATG5基因缺陷對(duì)ApcMin/+小鼠腸道腫瘤的影響(體內(nèi)試驗(yàn))實(shí)驗(yàn)?zāi)康模禾接憙?nèi)源性ATG5基因缺陷對(duì)ApcMin/+小鼠腸道腫瘤發(fā)展的影響。實(shí)驗(yàn)方法：由于ATG5-/-小鼠是無(wú)法存活的,在這里,我們使用腸道腺瘤模型小鼠ApcMin/+以及ATG5基因雜合性缺失的ATG5+/-小鼠,通過雜交繁育和基因鑒定等方法得到子代ATG5缺陷的ApcMin/+小鼠模型。通過比較子代ApcMin/+ATG5+/+與ApcMin/+ATG5+/-小鼠腸道腺瘤的大小和數(shù)目,確定ATG5缺陷對(duì)ApcMin/+小鼠腸道腫瘤生長(zhǎng)的影響；通過組織病理學(xué)試驗(yàn)得出ATG5缺陷對(duì)ApcMin/+小鼠腸道腫瘤惡性程度的影響；進(jìn)一步對(duì)腸道腫瘤進(jìn)行western blotting分析,檢測(cè)ATG5缺陷對(duì)腫瘤組織中自噬信號(hào)、凋亡相關(guān)信號(hào)通路、Wnt/β-catenin和EGFR/Erk1/2等腫瘤相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：基因缺陷小鼠生長(zhǎng)至4月齡時(shí),解剖發(fā)現(xiàn),ApcMin/+ATG5+/+小鼠與ApcMin/+ATG5+/-小鼠相比,腸道腺瘤的大小和數(shù)目無(wú)明顯差異(P0.05)；小鼠生長(zhǎng)至6月齡時(shí),解剖發(fā)現(xiàn),與ApcMin/+ATG5+/+小鼠相比,ApcMin/+ATG5+/-小鼠腸道腺瘤的數(shù)目有所增加,達(dá)到顯著性差異。組織病理學(xué)結(jié)果表明,雜合性ATG5缺陷不足以引起ApcMin/+小鼠的腸道腺瘤發(fā)生癌變,對(duì)腸道腺瘤的惡性程度無(wú)顯著影響。Western blotting實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),雜合性ATG5缺陷對(duì)腸道腫瘤細(xì)胞凋亡及自噬通路無(wú)顯著影響,但激活了腫瘤相關(guān)的Wnt/p-catenin和EGFR/Erk1/2信號(hào)通路,促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)論：雜合性ATG5缺陷可以促進(jìn)ApcMin/+小鼠腸道腫瘤的生長(zhǎng),但不足以引起ApcMin/+小鼠腸道腺瘤發(fā)生癌變。ATG5缺陷對(duì)腸道腫瘤生長(zhǎng)的促進(jìn)作用可能與對(duì)Wnt/β-catenin和EGFR/Erk1/2等腫瘤相關(guān)信號(hào)通路的促進(jìn)作用有關(guān),而與細(xì)胞的自噬和凋亡作用無(wú)關(guān)。第二節(jié)ATG5基因缺失對(duì)APC突變背景的結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29生長(zhǎng)的影響(體外實(shí)驗(yàn))實(shí)驗(yàn)?zāi)康模捍_定ATG5基因缺失對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。實(shí)驗(yàn)方法：使用lipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染ATG5-target siRNA,下調(diào)HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞中的ATG5基因水平；western blotting法檢測(cè)ATG5蛋白的表達(dá)水平,確定ATG5基因的沉默效率。通過MTT法檢測(cè)沉默ATG5對(duì)HT-29細(xì)胞增殖的影響；通過細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ATG5沉默對(duì)HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞克隆形成能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：使用ATG5-target siRNA,通過lipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞,western blotting試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),siRNA可以顯著降低ATG5的蛋白水平,沉默效率達(dá)90%以上。MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),ATG5沉默后HT-29細(xì)胞的增殖被顯著抑制。細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)得出相同的結(jié)論,即與沉默無(wú)關(guān)序列相比,沉默ATG5之后HT-29細(xì)胞的克隆形成能力受到顯著抑制。實(shí)驗(yàn)結(jié)論：ATG5沉默可以顯著抑制HT-29細(xì)胞的增殖,并且顯著抑制了HT-29細(xì)胞的克隆形成。我們推測(cè),ATG5缺失方式的不同以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬的差異等原因可能是造成體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致的因素。第三節(jié)ATG5基因缺陷顯著提高IFN-γ對(duì)ApcMin/+小鼠腸道腫瘤的抑制作用實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^動(dòng)物實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證ATG5基因缺陷可以提高抗腫瘤藥物的藥效作用。實(shí)驗(yàn)方法：使用腸道腺瘤ApcMin/+小鼠模型和雜合性ATG5缺陷的ATG5+/-小鼠模型,通過雜交繁育和基因鑒定等方法得到子代ApcMin/+ATG5+/-和ApcMin/+ATG5+/-小鼠模型。采用腹腔注射鼠源IFN-γ的方法,比較IFN-γ早期預(yù)防給藥以及晚期治療給藥前后ApcMin/+ATG5+/+與ApcMin/+ATG5+/-小鼠腸道腺瘤大小、數(shù)目的變化,通過組織病理學(xué)檢驗(yàn)分析給藥前后小鼠腸道腫瘤惡性程度的變化,確定雜合性ATG5缺陷對(duì)IFN-y療效的影響,進(jìn)一步確定ATG5基因缺陷是否可以提高IFN-y對(duì)ApcMin/+小鼠腸道腫瘤的抑制作用。通過對(duì)小鼠進(jìn)行攝食量、體重及血常規(guī)檢測(cè),分析IFN-y給藥所引起的毒性反應(yīng)。通過western blotting分析,檢測(cè)ATG5缺陷對(duì)IFN-y誘導(dǎo)的腫瘤相關(guān)信號(hào)通路Wnt/β-catenin和EGFR/Erk1/2的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：早期IFN-y預(yù)防給藥于腸道腫瘤尚未出現(xiàn)時(shí)開始,給藥3個(gè)月,中間休息一個(gè)月,晚期IFN-y治療給藥于腫瘤出現(xiàn)之后開始,給藥方式相同。給藥結(jié)束后解剖發(fā)現(xiàn),早期IFN-y預(yù)防給藥后,ApcMin/+ATG5+/-小鼠腸道腺瘤的數(shù)目與陰性對(duì)照組(給予生理鹽水)的ApcMin/+ATG5++/-小鼠相比明顯減少,下降了95.5%,組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn),給藥后,ApcMin/+ATG5+/-小鼠的腸道腺瘤極少,大多數(shù)部位僅見增生。而ApcMin/+ATG5+/+小鼠早期給藥IFN-γ后,腸道腺瘤數(shù)目較陰性對(duì)照組的ApcMin/+ATG5+/+小鼠雖有所減少,下降了43.3%,但仍見數(shù)目較多的腸道腺瘤以及較為嚴(yán)重的發(fā)育不良等病理學(xué)特征。因此,ATG5缺陷可大大提高IFN-γ早期預(yù)防給藥的效果。此外,ATG5缺陷還可提高晚期IFN-γ給藥的藥效,但提高的幅度較早期給藥小。鑒于早期IFN-γ給藥出現(xiàn)的良好的腺瘤抑制效果,我們進(jìn)一步檢測(cè)了IFN-γ給藥的毒性反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn),IFN-γ給藥對(duì)小鼠攝食量和體重?zé)o明顯影響；血常規(guī)結(jié)果表明,IFN-γ給藥后不僅未出現(xiàn)白細(xì)胞、血小板等血細(xì)胞的減少,反而出現(xiàn)血小板的略微上升,因此IFN-γ給藥可能有助于提高小鼠的自身免疫水平。Western blotting分析發(fā)現(xiàn),ATG5缺陷提高了IFN-γ對(duì)腫瘤相關(guān)信號(hào)通路Wnt/β-catenin和EGFR/Erk1/2的抑制作用,進(jìn)而提高了對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)論：ATG5基因缺陷提高了IFN-γ對(duì)ApcMin/+小鼠腸道腺瘤的抑制作用,此作用與ATG5缺陷提高了IFN-γ對(duì)Wnt/β-catenin和EGFR/Erk1/2信號(hào)通路的抑制作用有關(guān),此結(jié)論與文獻(xiàn)所報(bào)道的體外細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致,即ATG5基因缺陷可以提高抗腫瘤藥物的藥效�？偟膩�(lái)說(shuō),ATG5在腸道腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起了重要的作用,IFN-γ治療與ATG5基因缺陷或ATG5靶向抑制相結(jié)合可能成為結(jié)腸癌預(yù)防和治療的新方法。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)腸癌 APC IFN-γ ATG5 腸道腺瘤
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 中文摘要14-20
• ABSTRACT20-27
• 符號(hào)說(shuō)明27-30
• 前言30-47
• 1 結(jié)腸癌綜述31-38
• 1.1 結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制31-33
• 1.2 調(diào)控結(jié)腸癌發(fā)生和發(fā)展的基因33-36
• 1.3 APC基因與結(jié)腸癌36-38
• 2 Apc~(Min/+)小鼠模型38-41
• 2.1 Apc~(Min/+)小鼠模型介紹38-39
• 2.2 Apc~(Min/+)小鼠模型的應(yīng)用39-40
• 2.3 雙基因突變小鼠模型介紹40-41
• 2.4 雙基因突變小鼠模型的建立和應(yīng)用41
• 3 干擾素-γ基因缺陷與腸道腫瘤41-43
• 3.1 IFN-γ及其受體基因概述41-42
• 3.2 IFN-γ及其受體基因缺陷在腸道腫瘤研究中的意義42-43
• 4 自噬相關(guān)基因ATG5缺陷與腸道腫瘤43-47
• 4.1 自噬相關(guān)基因ATG5概述43-44
• 4.2 ATG5基因缺陷在腸道腫瘤研究中的意義44-45
• 4.3 ATG5基因缺陷在腸道腫瘤治療中的意義45-47
• 第一部分 干擾素-γ基因缺陷對(duì)APC突變所致腸道腫瘤的影響47-81
• 第一節(jié) 內(nèi)源性干擾素-γ基因缺陷對(duì)Apc~(Min/+)小鼠腸道腫瘤的影響47-70
• 1 實(shí)驗(yàn)材料47-54
• 1.1 動(dòng)物47
• 1.2 試劑47-49
• 1.3 試劑配制49-53
• 1.4 儀器設(shè)備53-54
• 2 實(shí)驗(yàn)方法54-60
• 2.1 雙基因缺陷小鼠模型的建立54
• 2.2 雙基因缺陷小鼠基因型鑒定54-56
• 2.3 小鼠腸道腫瘤大小與數(shù)目統(tǒng)計(jì)56
• 2.4 小鼠腸道腫瘤組織病理學(xué)研究56
• 2.5 使用ELISA法檢測(cè)小鼠血清IFN-γ水平56
• 2.6 免疫組化方法檢測(cè)小鼠腸道腫瘤組織中免疫分子的表達(dá)56-58
• 2.7 使用Western-blotting法檢測(cè)腸道腫瘤組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)58-60
• 2.8 數(shù)據(jù)處理60
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果60-67
• 3.1 雜合性IFN-γ缺失促進(jìn)Apc~(Min/+)小鼠腸道腫瘤的生長(zhǎng)60-62
• 3.2 雜合性IFN-γ缺失可以引起Apc~(Min/+)小鼠腸道腫瘤發(fā)生癌變62-63
• 3.3 雜合性IFN-γ缺失降低了血清干擾素-γ水平63-64
• 3.4 雜合性IFN-γ缺失調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中免疫因子的數(shù)目和分布64-65
• 3.5 雜合性IFN-γ缺失促進(jìn)Wnt/β-catenin及EGFR/ERK1/2信號(hào)通路的活化65-67
• 3.6 雜合性IFN-γ缺失抑制β-catenin的降解67
• 4 討論與結(jié)論67-70
• 第二節(jié) 干擾素-γ受體基因缺失對(duì)APC突變背景的結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響70-81
• 1 實(shí)驗(yàn)材料70-73
• 1.1 細(xì)胞株70
• 1.2 試劑70-71
• 1.3 試劑配制71-72
• 1.4 儀器設(shè)備72-73
• 2 實(shí)驗(yàn)方法73-75
• 2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)73
• 2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖試驗(yàn)73-74
• 2.3 細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)74
• 2.4 Western-blotting法檢測(cè)細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)74
• 2.5 數(shù)據(jù)處理74-75
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果75-79
• 3.1 小干擾RNA有效抑制IFN_γR1蛋白的表達(dá)75
• 3.2 HT-29細(xì)胞沉默IFN_γR1后對(duì)IFN-γ的抑制作用不敏感75-76
• 3.3 MTT法未檢測(cè)到IFN_γR1缺陷對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29增殖的影響76
• 3.4 IFN_γR1基因缺陷促進(jìn)HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞的克隆形成76-77
• 3.5 IFN_γR1基因缺陷促進(jìn)Wnt/β-catenin和EGFR/ERK1/2信號(hào)通路的活化77-78
• 3.6 IFN-γ對(duì)HT-29細(xì)胞(突變型APC基因)增殖具有顯著抑制作用,而對(duì)HCT-116細(xì)胞(野生型APC基因)的增殖無(wú)明顯抑制作用78-79
• 3.7 IFN-γ抑制HT-29細(xì)胞增殖的機(jī)制79
• 4 討論與結(jié)論79-81
• 第二部分 自噬相關(guān)基因ATG5缺陷對(duì)APC突變所致腸道腫瘤的影響81-106
• 第一節(jié) 內(nèi)源性的ATG5基因缺陷對(duì)Apc~(Min/+)小鼠腸道腫瘤的影響81-90
• 1 實(shí)驗(yàn)材料81-82
• 1.1 動(dòng)物81-82
• 1.2 試劑82
• 1.3 試劑配制82
• 1.4 儀器設(shè)備82
• 2 實(shí)驗(yàn)方法82-84
• 2.1 雙基因缺陷小鼠模型的建立82-83
• 2.2 雙基因缺陷小鼠基因型鑒定83
• 2.3 小鼠腸道腫瘤大小與數(shù)目統(tǒng)計(jì)83
• 2.4 小鼠腸道腫瘤組織病理學(xué)研究83
• 2.5 Western-blotting法檢測(cè)小鼠腸道腫瘤組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)83
• 2.6 數(shù)據(jù)處理83-84
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果84-88
• 3.1 ATG5基因缺陷可以在一定程度上促進(jìn)Apc~(Min/+)小鼠腸道腫瘤的生長(zhǎng)84-85
• 3.2 ATG5基因缺陷對(duì)Apc~(Min/+)小鼠腸道腫瘤的進(jìn)展無(wú)顯著影響85-86
• 3.3 ATG5基因缺陷對(duì)細(xì)胞自噬水平無(wú)顯著影響86
• 3.4 ATG5基因缺陷對(duì)細(xì)胞凋亡水平無(wú)顯著影響86-87
• 3.5 ATG5基因缺陷促進(jìn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化87-88
• 3.6 ATG5基因缺陷促進(jìn)EGFR/Erk1/2信號(hào)通路的活化88
• 4 討論與結(jié)論88-90
• 第二節(jié) ATG5基因敲除對(duì)APC突變背景的結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響90-95
• 1 實(shí)驗(yàn)材料90-91
• 1.1 細(xì)胞株90
• 1.2 試劑90
• 1.3 試劑配制90
• 1.4 儀器設(shè)備90-91
• 2 實(shí)驗(yàn)方法91
• 2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)91
• 2.2 細(xì)胞增殖試驗(yàn)91
• 2.3 細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)91
• 2.4 數(shù)據(jù)處理91
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果91-93
• 3.1 ATG5基因缺陷可以顯著抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的增殖91-92
• 3.2 ATG5基因缺陷抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的克隆形成92-93
• 4 討論與結(jié)論93-95
• 第三節(jié) ATG5基因缺陷顯著提高了干擾素-γ對(duì)Apc~(Min/+)小鼠腸道腫瘤的抑制作用95-106
• 1 實(shí)驗(yàn)材料95-96
• 1.1 動(dòng)物95
• 1.2 試劑95-96
• 1.3 試劑配制96
• 1.4 儀器設(shè)備96
• 2 實(shí)驗(yàn)方法96-97
• 2.1 小鼠腸道腫瘤大小與數(shù)目統(tǒng)計(jì)96
• 2.2 小鼠腸道腫瘤組織病理學(xué)研究96-97
• 2.3 小鼠體重和攝食量測(cè)定97
• 2.4 小鼠血常規(guī)測(cè)定97
• 2.5 Western-blotting法檢測(cè)腸道腫瘤組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)97
• 2.6 數(shù)據(jù)處理97
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果97-104
• 3.1 ATG5基因缺陷提高了IFN-γ對(duì)Apc~(Min/+)小鼠腸道腫瘤的抑制作用97-100
• 3.2 IFN-γ給藥對(duì)小鼠體重?zé)o顯著影響100-101
• 3.3 IFN-γ給藥對(duì)小鼠攝食量無(wú)顯著影響101
• 3.4 IFN-γ給藥不會(huì)降低小鼠外周血中白細(xì)胞及血小板的數(shù)量101-102
• 3.5 ATG5基因缺陷提高了IFN-γ對(duì)Wnt/β-catenin和EGFR/ERK1/2信號(hào)的抑制作用102-103
• 3.6 ATG5基因缺陷提高了IFN-γ對(duì)β-catenin核轉(zhuǎn)移的抑制作用103-104
• 4 討論與結(jié)論104-106
• 全文總結(jié)106-107
• 論文的創(chuàng)新性及意義107
• 論文的不足之處107-108
• 參考文獻(xiàn)108-121
• 致謝121-122
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文122-123
• 代表性論文全文123-146
• 論文1123-131
• 論文2131-140
• 論文3140-146
• 附件146

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前7條

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本文編號(hào)：689079