本文關(guān)鍵詞：心肌成纖維細(xì)胞來源的exosome在血管緊張素-2誘導(dǎo)的心肌肥大中的作用及機(jī)制研究

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【摘要】：研究背景心肌肥大是長期高血壓、冠心病、瓣膜性心臟病、肥厚性心肌病等多種心臟疾病的共同病理過程。心肌肥大的基本特征是心肌細(xì)胞體積增大、蛋白質(zhì)合成速率增加、膠原纖維密度增加、肌節(jié)數(shù)量增加與結(jié)構(gòu)重組以及胚胎期基因的重新表達(dá)。盡管早期的心肌肥大被認(rèn)為是一種應(yīng)激狀態(tài)下的代償反應(yīng),但是長期適應(yīng)不良性心肌肥大往往伴隨著心室擴(kuò)張、室壁變薄,最終導(dǎo)致心輸出量進(jìn)行性下降、心力衰竭加重和心源性猝死發(fā)生率的增加。心肌肥大的主要誘發(fā)因素包括機(jī)械刺激及多種神經(jīng)體液因子,前者包括各種壓力負(fù)荷、容量負(fù)荷的刺激,后者包括兒茶酚胺、Ang Ⅱ、ET-1、心房利鈉肽(ANP)等,另外某些生長因子如表皮生長因子(EGF)、血小板源性生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)也可誘導(dǎo)心肌肥大。介導(dǎo)病理性心肌肥大刺激與基因活化的信號通路有多條,其中MAPK途徑起著至關(guān)重要的作用。MAPK家族有ERK、JNK、p38三個主要成員。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS),又稱為腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS),對維持人體血壓、電解質(zhì)與體液平衡、心血管系統(tǒng)發(fā)育與功能意義重大�，F(xiàn)在認(rèn)為心肌局部RAS在促進(jìn)心肌重構(gòu)中的作用,可能較循環(huán)RAS更為重要。目前認(rèn)為在心肌重構(gòu)中起主導(dǎo)作用的Ang Ⅱ受體是Ang Ⅱ 1型受體(Ang Ⅱ typel receptor, AT1R), Ang Ⅱ 2型受體(Ang Ⅱ type2 receptor, AT2R)的作用尚存在爭議。RAS持續(xù)激活可使心肌發(fā)生肥大、纖維化和壞死,損害心臟功能,最終導(dǎo)致心臟功能由代償逐漸走向失代償。心肌成纖維細(xì)胞約占正常心肌組織細(xì)胞總數(shù)的60%-70%,體積約占正常心臟體積的三分之一。心肌成纖維細(xì)胞除了產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)、為心肌細(xì)胞提供支持、參與損傷后修復(fù)外,還可以通過分泌Ang Ⅱ、TGFβ1、FGF-1、exosome等影響心肌細(xì)胞的生長發(fā)育與舒縮功能。Exosome(外泌體)是一種細(xì)胞分泌的具有杯狀形態(tài)、直徑約為30-100nm的微囊泡�；舅械募�(xì)胞都能分泌exosome, exosome還天然存在于體液中,攜帶處于不同狀態(tài)下的細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)、miRNA、長鏈非編碼RNA(lncRNA)及mRNA等物質(zhì)。近年來,exosome因其在細(xì)胞間訊的重要作用正得到廣泛的關(guān)注。本研究旨在從RAS角度揭示心肌成纖維細(xì)胞exosome與心肌肥大、心力衰竭的關(guān)系。研究目的1.建立心肌成纖維細(xì)胞exosome提取體系；2.觀察心肌成纖維細(xì)胞exosome對心肌細(xì)胞肥大的影響,并探討其機(jī)制。研究方法1.細(xì)胞培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)采用出生1-3天的SD大鼠心臟分離和培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞作為研究對象。2.Exosome制備與鑒定采用差速離心聯(lián)合密度梯度離心法提取exosome;采用透射電鏡與Western blot技術(shù)鑒定exosome。3.心肌細(xì)胞肥大測定采用心肌細(xì)胞平均表面積測量和3H-亮氨酸摻入實(shí)驗(yàn)評估心肌細(xì)胞肥大。4.實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot、細(xì)胞免疫熒光染色采用2-ΔΔCT坩法測定mRNA目對水平。Western blot、細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)按標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行。5.Ang Ⅱ檢測采用酶免疫法(The Enzyme Immunoassay, EIA)檢測心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清及心肌成纖維細(xì)胞exosome中的Ang Ⅱ含量。9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤形式表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 17.0進(jìn)行,P0.05視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究結(jié)果1心肌成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)心肌細(xì)胞病理性肥大與對照組相比,心肌成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基(CF CM,50%, V/V)刺激心肌細(xì)胞48h明顯增加心肌細(xì)胞的表面積、蛋白質(zhì)合成速率,明顯升高心肌細(xì)胞ANP、BNP、βMHC mRNA表達(dá)水平,降低α MHC mRNA表達(dá)水平。2替米沙坦能夠阻斷心肌成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大相對對照組,CF CM能夠明顯升高心肌細(xì)胞AT1R、AT2R mRNA表達(dá)水平。血管緊張素Ⅱ 1型受體(AT1R)拮抗劑替米沙坦(50μ M)能夠完全抑制CF CM誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大,AT2R拮抗劑PD123319(50μ M)能夠部分抑制心肌成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大,兩種拮抗劑聯(lián)用具有協(xié)調(diào)作用。3心肌成纖維細(xì)胞exosome的分離與鑒定本課題中我們采用差速離心聯(lián)合密度梯度離心法從心肌成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基中提取exosome。透射電鏡顯示,獲得的心肌成纖維細(xì)胞來源的囊泡符合exosome的特征：具有雙層膜結(jié)構(gòu)與杯狀外形；直徑多數(shù)在40-100nm之間,平均70nm。Western blot實(shí)驗(yàn)顯示,該種囊泡表達(dá)CD9、CD63、HSP70、TSG101這幾種exosome標(biāo)志性蛋白,calnexin表達(dá)陰性。同時(shí),該囊泡還表達(dá)波形蛋白(vimentin),可見實(shí)驗(yàn)中分離獲得的囊泡確實(shí)是心肌成纖維細(xì)胞來源的exosomeo4心肌成纖維細(xì)胞exosome能夠被心肌細(xì)胞攝取我們將PKH67綠色熒光標(biāo)記的exosome與心肌細(xì)胞共培養(yǎng),然后使用活細(xì)胞共聚焦顯微鏡觀察CF exosome與心肌細(xì)胞之間的相互作用,發(fā)現(xiàn)心肌成纖維細(xì)胞exosome能夠被心肌細(xì)胞攝取。5心肌成纖維細(xì)胞exosome能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞病理性肥大相對于對照組,50 μ g/ml的CF exosome刺激心肌細(xì)胞48小時(shí)明顯增加心肌細(xì)胞的表面積、蛋白質(zhì)合成速率,明顯升高心肌細(xì)胞ANP、BNP、β MHC mRNA 表達(dá)水平,降低a MHC、SERCA2a的mRNA表達(dá)水平。另外,10 μ g/ml的CF exosome促心肌細(xì)胞肥大能力與Ang Ⅱ(1μM)相當(dāng)。1-50 μ g/ml的CF exosomes降低SERCA2a mRNA表達(dá)水平的作用均強(qiáng)于Ang Ⅱ (1μM)。6去除exosome能夠降低心肌成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基的促肥大能力我們采用110,000g離心過夜的方法將exosome從心肌成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基中盡可能地去除。3H-亮氨酸摻入實(shí)驗(yàn)顯示,去除exosome的CF CM的促肥大能力低于正常CF CM,去除exosome降低了CF CM的促肥大能力。7心肌成纖維細(xì)胞exosome能夠激活心肌細(xì)胞腎素-血管緊張素系統(tǒng),增加心肌細(xì)胞Ang Ⅱ分泌量相對對照組,心肌成纖維細(xì)胞exosome與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)48h顯著升高了心肌細(xì)胞血管緊張素原(AGT)、腎素(renin)、AT1R、AT2R的mRNA表達(dá)水平,顯著降低了血管緊張素轉(zhuǎn)化酶-2(ACE2)的mRNA水平。酶免疫實(shí)驗(yàn)(EIA)數(shù)據(jù)顯示：相對對照組,心肌成纖維細(xì)胞exosome與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)48h明顯增加了心肌細(xì)胞Ang Ⅱ分泌量。8 EIA數(shù)據(jù)顯示,心肌成纖維細(xì)胞來源的exosome中不含有Ang Ⅱ。9替米沙坦、PD123319能夠阻斷心肌成纖維細(xì)胞exosome的促心肌細(xì)胞肥大作用3H-亮氨酸摻入實(shí)驗(yàn)顯示,AT1R拮抗劑替米沙坦、AT2R拮抗劑PD123319能夠濃度依賴性地抑制CF exosome引起的心肌細(xì)胞肥大。50μM的替米沙坦與PD123319能夠分別完全阻斷CF exosome引起的心肌細(xì)胞肥大,并且二者聯(lián)用具有協(xié)同作用。10 ERK、JNK、p38通路磷酸化抑制劑能夠抑制心肌成纖維細(xì)胞exosome激活的腎素-血管緊張素系統(tǒng)、Ang Ⅱ分泌Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CF exosome能夠激活心肌細(xì)胞內(nèi)ERK、JNK、 p38通路。接下來的數(shù)據(jù)顯示,CF exosome升高心肌細(xì)胞AGT、AT1R、AT2R mRNA以及降低ACE2 mRNA的作用能夠被ERK、JNK、p38磷酸化抑制劑所阻斷。另外,CF exosome誘導(dǎo)心肌細(xì)胞Ang Ⅱ分泌量增加的作用也可以被ERK、JNK、p38磷酸化抑制劑所阻斷。11抑制ERK、JNK、p38通路磷酸化能夠阻斷心肌成纖維細(xì)胞exosome誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大3H-亮氨酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CF exosome的促心肌細(xì)胞肥大作用能夠被ERK、JNK、 p38通路磷酸化抑制劑所阻斷。研究結(jié)論1心肌成纖維細(xì)胞分泌的exosome能夠通過AngⅡ受體誘導(dǎo)病理性心肌細(xì)胞肥大；2心肌成纖維細(xì)胞exosome是心肌成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)病理性心肌細(xì)胞肥大的重要途徑；3 ERK、JNK、p38通路磷酸化介導(dǎo)了心肌成纖維細(xì)胞exosome誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大；4心肌成纖維細(xì)胞exosome通過激活心肌細(xì)胞腎素-血管緊張素系統(tǒng)、促進(jìn)心肌細(xì)胞分泌Ang Ⅱ促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大；5心肌成纖維細(xì)胞exosome激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)依賴于MAPK通路磷酸化；綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)心肌成纖維細(xì)胞分泌的exosome能夠通過MAPK通路激活心肌細(xì)胞腎素-血管緊張素系統(tǒng),從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生病理性肥大。研究背景心臟疾病是全世界死亡率最高的疾病’,心力衰竭是各種心臟疾病的終末期階段。目前慢性心衰的防治策略已經(jīng)從過去單純強(qiáng)心轉(zhuǎn)變?yōu)槟壳暗恼{(diào)節(jié)心肌重構(gòu),抑制Ang Ⅱ、兒茶酚胺等神經(jīng)體液因子的過度激活。心肌重構(gòu)在組織學(xué)上表現(xiàn)為心肌肥大與纖維化；細(xì)胞學(xué)上表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大、心肌細(xì)胞凋亡,心肌成纖維細(xì)胞增殖與細(xì)胞外基質(zhì)分泌增加。多種刺激因素均可導(dǎo)致心肌重構(gòu),包括機(jī)械牽張、壓力負(fù)荷及多種神經(jīng)體液因子如兒茶酚胺、血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ).內(nèi)皮素-1(ET-1)、心房利鈉肽(ANP)等,某些生長因子如表皮生長因子(EGF)、血小板源性生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)也可誘導(dǎo)心肌重構(gòu)。機(jī)械牽張、壓力負(fù)荷既可以通過跨膜的細(xì)胞外基質(zhì)受體將刺激信號導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi),也可以通過激活兒茶酚胺、Ang Ⅱ、ET-1等激活心肌細(xì)胞肥大與成纖維細(xì)胞增殖的相關(guān)通路。可見,AngⅡ是心肌重構(gòu)的重要參與者。Ang Ⅱ可誘導(dǎo)即刻早期反應(yīng)基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)合成的增加,表現(xiàn)為收縮血管,增強(qiáng)心肌收縮力,觸發(fā)心肌肥大、纖維組織和血管增生。然而,這些適應(yīng)性反應(yīng)是許多心血管事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在心肌重構(gòu)的過程中,SERCA2a活性降低是心臟功能失代償、走向心衰的重要機(jī)制。轉(zhuǎn)基因過表達(dá)SERCA2a可以調(diào)高心臟的泵功能,改善血流動力學(xué)狀況,使患者遠(yuǎn)期受益。論文Ⅰ中,我們發(fā)現(xiàn)CF exosome能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞分泌Ang Ⅱ,降低心肌細(xì)胞SERCA2a mRNA表達(dá)水平。可見,在體內(nèi)水平CF exosome可能作為一個種旁分泌途徑參與了Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)。研究目的探索AngⅡ?qū)π募〕衫w維細(xì)胞exosome的分泌與促肥大作用的影響,闡釋CFexosome在AngⅡ誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)與左心室SERCA2a表達(dá)水平降低中的的作用。研究方法1.細(xì)胞培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)采用出生1-3天的SD大鼠心臟分離和培養(yǎng)心肌原代細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞作為研究對象。2.Exosome制備與鑒定采用超速離心聯(lián)合密度梯度離心法提取exosome;采用透射電鏡、Wetern blot技術(shù)鑒定CF exosome。3細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)采用美國羅氏公司生產(chǎn)的乳酸脫氫酶試劑盒檢測藥物對心肌成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞的毒性。4心肌成纖維細(xì)胞與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)采用Corning公司生產(chǎn)的transwell 24孔板共培養(yǎng)兩種細(xì)胞。成纖維細(xì)胞接種在上層培養(yǎng)孔中,心肌細(xì)胞接種到明膠處理的下層培養(yǎng)孔中,兩種細(xì)胞間隔0.4gm孔徑的薄膜共培養(yǎng)48小時(shí)。5.心肌細(xì)胞肥大測定采用3H-亮氨酸摻入實(shí)驗(yàn)評估心肌細(xì)胞肥大。6.Western blot、實(shí)時(shí)定量PCRWestern blot、實(shí)時(shí)定量PCR按標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行操作。采用2-ΔΔCT法測定mRNA相對水平。7.動物分組52只8周雄性C57BL/6J小鼠隨進(jìn)分為六組：正常對照組、GW4869注射組、DMA注射組、Ang Ⅱ注射組、Ang Ⅱ注射+GW4869注射組、Ang Ⅱ注射+DMA注射組。通過小鼠肩胛間區(qū)皮下植入滲透壓微量泵注射Ang Ⅱ兩周的方法誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生心肌肥厚,觀察exosome分泌抑制劑GW4869、DMA對正常及Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)小鼠體重、血壓、心率、心臟重量、心肌橫截面積、心肌纖維化比例以、左心室肥大及纖維化相關(guān)基因、SERCA2a表達(dá)水平的影響。8.血壓和心率測量采用tail-cuff法測量尾動脈收縮伍、舒張壓、平均動脈壓和心率。9.組織學(xué)分析使用切片機(jī)切出厚度為5μm的石蠟切片,用于麥胚凝集素(WGA)和Masson染色以評價(jià)左室心肌組織肥大及纖維化程度。10.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤形式表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 17.0進(jìn)行,P0.05視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究結(jié)果1.Ang Ⅱ刺激增加心肌成纖維細(xì)胞exosome分泌量Ang Ⅱ (1 μ M)能夠至少使心肌成纖維細(xì)胞exosome分泌量增加43%,胰島素(insulin,0.1 μ M)、脂多糖(LPS,0.1 μg/ml)、過氧化氫(H2O2,500 μM)等刺激因子未能改變心肌成纖維細(xì)胞的exosome分泌量。3H亮氨酸摻入實(shí)驗(yàn)驗(yàn)表明,正常培養(yǎng)及上述病理因子刺激的成纖維細(xì)胞分泌的exosome促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大能力沒有差異。2.替米沙坦、PD123319抑制Ang Ⅱ刺激增加的心肌成纖維細(xì)胞exosome分泌量替米沙坦(10μM)、PD123319(10μ M)均能抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的CF exosome分泌量增加,二者聯(lián)用具有協(xié)同作用。3H亮氨酸摻入實(shí)驗(yàn)驗(yàn)表明,正常培養(yǎng)及Ang Ⅱ、替米沙坦、PD123319刺激過的成纖維細(xì)胞分泌的exosome促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大能力沒有差異。3.GW4869、DMA能夠抑制Ang Ⅱ聯(lián)合心肌成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大GW4869 (40 μ M)、DMA (100nM)能有效地抑制CF exosome的分泌,并且對心肌細(xì)胞與心肌成纖維細(xì)胞都不具有毒性。Ang Ⅱ聯(lián)合心肌成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)的促心肌細(xì)胞肥大能力明顯高于AngⅡ、CF共培養(yǎng)單種刺激因素；AngⅡ聯(lián)合心肌成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)的促肥大能力能夠被GW4869、DMA明顯抑制,并且GW4869 (40uM)、DMA (100nM)不影響AngⅡ刺激組心肌細(xì)胞的CPM值。4腹腔注射GW4869、DMA能夠抑制Ang Ⅱ微量泵注射兩周引起的小鼠心肌肥大經(jīng)過兩周Ang Ⅱ微量泵皮下注射,小鼠心肌肥大明顯；GW4869、DMA腹腔注射能夠顯著抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠心肌肥大,Ang Ⅱ+GW486、AngⅡ+DMA組小鼠HW/BW.左心室心肌細(xì)胞橫截面積較Ang Ⅱ組明顯降低。AngⅡ+GW4869、Ang Ⅱ+DMA組小鼠左心室胚胎基因ANP、BNP、βMHC mRNA表達(dá)水平較Ang Ⅱ組明顯降低,a MHC mRNA表達(dá)水平較Ang Ⅱ組明顯升高。5腹腔注射GW4869、DMA能夠抑制Ang Ⅱ微量泵注射兩周引起的小鼠心肌纖維化經(jīng)過兩周Ang Ⅱ微量泵皮下注射,小鼠心肌纖維化明顯；GW4869、DMA腹腔注射能夠顯著抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠心肌纖維化,Ang Ⅱ+GW4869、Ang Ⅱ+DMA組小鼠左心室纖維化比例以及膠原Ⅰ、膠原Ⅲ、TGFβ1、CTGF mRNA表達(dá)水平較Ang Ⅱ組明顯降低。6腹腔注射GW4869、DMA緩解Ang Ⅱ微量泵注射兩周引起的小鼠左心室SERCA2a表達(dá)水平降低經(jīng)過兩周Ang Ⅱ微量泵皮下注射,小鼠左心室SERCA2a蛋白及mRNA表達(dá)水平明顯降低；GW4869、DMA腹腔注射能夠顯著抑制Ang Ⅱ的上述效應(yīng),AngⅡ+GW4869、Ang Ⅱ+DMA組小鼠SERCA2a蛋白及mRNA表達(dá)水平較Ang Ⅱ組明顯升高。研究結(jié)論1.Ang Ⅱ能夠通過血管緊張素Ⅰ受體增加心肌成纖維細(xì)胞exosome分泌；2.腹腔注射exosome分泌抑制劑GW4869或者DMA能夠緩解AngⅡ微量泵注射誘導(dǎo)的小鼠心肌肥大；3.腹腔注射exosome分泌抑制劑GW4869或者DMA能夠緩解AngⅡ微量泵注射誘導(dǎo)的小鼠心肌纖維化；4.腹腔注射exosome分泌抑制劑GW4869或者DMA能夠緩解AngⅡ微量泵注射誘導(dǎo)的小鼠心肌SERCA2a表達(dá)降低�？傊�,CF exosome作為一種旁分泌途徑參與了Ang Ⅱ微量泵注射誘導(dǎo)的小鼠心肌重構(gòu)。
【關(guān)鍵詞】：心肌成纖維細(xì)胞 外泌體 血管緊張素-2 心肌重構(gòu) 腎素-血管緊張素系統(tǒng) 心肌成纖維細(xì)胞 外泌體 血管緊張素-2 心肌重構(gòu) 腎素-血管緊張素系統(tǒng)
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R542.2
【目錄】：

• 第一部分：心肌成纖維細(xì)胞來源的exosome通過激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大8-58
• 中文摘要8-13
• Abstract13-16
• 符號說明16-20
• 前言20-23
• 材料與方法23-35
• 研究結(jié)果35-38
• 討論38-41
• 結(jié)論41-42
• 創(chuàng)新點(diǎn)42
• 局限性42-43
• 附圖表43-55
• 參考文獻(xiàn)55-58
• 第二部分：心肌成纖維細(xì)胞exosome作為一種旁分泌途徑參與血管緊張素-2誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)58-101
• 中文摘要58-62
• 英文摘要62-65
• 符號說明65-68
• 前言68-70
• 材料與方法70-77
• 研究結(jié)果77-82
• 討論82-84
• 結(jié)論84
• 創(chuàng)新點(diǎn)84-85
• 局限性85-86
• 附圖86-98
• 參考文獻(xiàn)98-101
• 英文文章1101-137
• 英文文章2137-154
• 致謝154-155
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表155

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 顧東風(fēng) ,黃廣勇 ,吳錫桂 ,段秀芳 ,何江 ,Paul K Whelton ,Stephen Mac Mahon;中國心力衰竭流行病學(xué)調(diào)查及其患病率[J];中華心血管病雜志;2003年01期

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本文編號：639678