發(fā)布時間：2017-07-28 20:11

  本文關(guān)鍵詞：線粒體CB1受體的神經(jīng)保護作用及機制研究

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【摘要】：【背景】呼吸心跳驟停病人實施心肺復蘇后的死亡率高達近70%,其中最主要的死亡原因是中樞神經(jīng)損傷。并且在存活的病人中有近2/3在心跳驟停發(fā)生3個月后出現(xiàn)中到重度的認知功能障礙,給患者及家庭帶來沉重打擊,也給社會造成非常大的經(jīng)濟負擔。因此,在復蘇的同時或者復蘇后針對腦損傷進行預防和治療變得尤為重要。線粒體作為細胞的能量工廠,參與細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、凋亡等生理過程。腦缺血再灌注損傷后,線粒體更是在多個環(huán)節(jié)參與神經(jīng)損傷,表明線粒體是腦缺血再灌注所致神經(jīng)元損傷的重要機制之一,是有望進行臨床轉(zhuǎn)化的腦缺血再灌注損傷治療的新靶點,但目前仍然缺乏對線粒體安全有效的干預藥物或措施。最新發(fā)表在Nature Neuroscience上的研究發(fā)現(xiàn):小鼠神經(jīng)元線粒體膜上存在大麻素CB1受體,即線粒體CB1(mt CB1)受體,在生理狀態(tài)下可直接調(diào)節(jié)線粒體的呼吸和能量代謝。然而,在腦缺血再灌注損傷后,是否可以通過激活mt CB1受體改善線粒體功能從而產(chǎn)生神經(jīng)保護作用仍不清楚,其可能的潛在機制更不明確。本研究選擇原代大鼠海馬神經(jīng)元氧糖剝奪/復氧復糖(OGD/R)、小鼠全腦缺血再灌注(I/R)和Ca2+誘導的線粒體損傷模型,以mt CB1受體為切入點,綜合應(yīng)用分子生物學、免疫電鏡等技術(shù),研究激活mt CB1受體的神經(jīng)保護作用,并初步探索其作用機制,從而為腦缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展提供新的防治策略,為臨床提供新的潛在干預靶點。實驗一選擇性激活mt CB1受體【目的】通過應(yīng)用選擇性CB1受體激動劑和透膜或非透膜拮抗劑,確定合適的選擇性激活mt CB1受體方法�！痉椒ā�(1)mtCB1受體表達的時相變化。55只雄性C57BL/6小鼠被隨機分為3組,分別為Sham組、BCCAO組和ACEA+BCCAO組,分別在再灌注的同時給予ACEA腹腔注射,在再灌注后2、6、24、48和72小時分別提取各組小鼠海馬組織線粒體蛋白,利用Western blot檢測mt CB1受體表達水平;(2)CB1受體選擇性激動劑ACEA對mt CB1受體表達的影響。在體外實驗,原代大鼠海馬神經(jīng)元被分為5組(n=5):Control組、ACEA組、AM251+ACEA組、Hemo+ACEA組和Vehicle組,分別在給藥后的2小時提取線粒體蛋白及去除線粒體后剩余蛋白,利用Western blot檢測CB1受體表達水平;在體內(nèi)試驗,40只雄性C57BL/6小鼠被隨機分為5組:Control組、ACEA組、AM251+ACEA組、Hemo+ACEA組和Vehicle組,分別在給藥后的2小時,利用Western blot(n=5)及免疫電鏡(n=3)檢測mt CB1受體表達水平;(3)OGD/R或全腦I/R損傷對mt CB1受體表達的影響。在體外實驗,原代大鼠海馬神經(jīng)元被分為6組(n=5),分別為Control組、OGD組、ACEA+OGD組、AM251+ACEA+OGD組、Hemo+ACEA+OGD組和Vehicle+OGD組,分別在復氧復糖的同時給藥,在復氧復糖后2小時提取線粒體蛋白及去除線粒體后剩余蛋白,利用Western blot檢測CB1受體表達水平;在體內(nèi)試驗,30只雄性C57BL/6小鼠被隨機分為6組(n=5),分別為Sham組、BCCAO組、ACEA+BCCAO組、AM251+ACEA+BCCAO組、Hemo+ACEA+BCCAO組和Vehicle+BCCAO組,分別在再灌注的同時給藥,在再灌注后2小時提取海馬組織線粒體蛋白及去除線粒體后剩余蛋白,利用Western blot檢測CB1受體表達水平�！窘Y(jié)果】(1)mt CB1受體在全腦I/R后2小時表達顯著增加。與Sham組比較,全腦I/R后2小時,ACEA顯著增加mt CB1受體表達(P0.05),而在隨后的時間點,其表達逐漸降低;(2)ACEA上調(diào)體外培養(yǎng)神經(jīng)元及小鼠海馬組織的mt CB1受體。與Control組比較,ACEA可以顯著上調(diào)mt CB1的表達(P0.05),能夠透過細胞膜的選擇性CB1受體拮抗劑AM251完全逆轉(zhuǎn)了這一效應(yīng)(P0.05),而不能透過細胞膜的CB1受體拮抗劑hemopressin卻未能逆轉(zhuǎn);對除去線粒體后剩余蛋白檢測CB1受體表達,發(fā)現(xiàn)只有ACEA組的CB1受體較Control組表達增高(P0.05);(3)mt CB1受體在OGD/R或全腦I/R損傷后表達增加。與Control組比較,OGD/R上調(diào)mt CB1受體;與Sham組比較,全腦I/R也上調(diào)mt CB1受體,ACEA可進一步增加其表達(P0.05),這一效應(yīng)可以被AM251完全逆轉(zhuǎn)(P0.05),但卻不能被hemopressin所逆轉(zhuǎn);對去除線粒體后剩余蛋白進行檢測,發(fā)現(xiàn)OGD/R或全腦I/R同樣可以顯著上調(diào)CB1受體(P0.05),ACEA也可進一步增加其表達(P0.05),而AM251和hemopressin均完全拮抗這一效應(yīng)(P0.05)�！窘Y(jié)論】通過給予透膜的選擇性CB1受體激動劑ACEA和非透膜的選擇性CB1受體拮抗劑hemopressin可以選擇性激活mt CB1受體。實驗二激活mt CB1受體的神經(jīng)保護作用研究【目的】探討激活mt CB1受體對OGD/R和全腦I/R損傷的神經(jīng)保護作用�！痉椒ā�(1)原代大鼠海馬神經(jīng)元被分為6組:Control組、OGD組、ACEA+OGD組、AM251+ACEA+OGD組、Hemo+ACEA+OGD組和Vehicle+OGD組,在復氧復糖的同時分別給藥,在復氧復糖后24小時,分別檢測各組細胞的細胞活性(n=8)、乳酸脫氫酶(LDH)釋放量(n=6)和流式細胞凋亡率(n=5);(2)60只雄性C57BL/6小鼠被隨機分為6組(n=10):Sham組、BCCAO組、ACEA+BCCAO組、AM251+ACEA+BCCAO組、Hemo+ACEA+BCCAO組和Vehicle+BCCAO組,在再灌注的同時分別腹腔給藥,在再灌注后的24、48和72小時,分別評估各組小鼠神經(jīng)行為學評分;最后一次評估后(再灌注后72小時),對各組小鼠斷頭取腦,TUNEL檢測海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡率(n=5);Western blot檢測海馬組織凋亡蛋白表達水平(n=5)�！窘Y(jié)果】(1)在復氧復糖后24小時,ACEA顯著增加神經(jīng)元活性,減少LDH釋放量,降低神經(jīng)元凋亡率(P0.05),AM251能夠完全逆轉(zhuǎn)這一結(jié)果(P0.05),而hemopressin僅僅部分或無逆轉(zhuǎn);(2)全腦缺血再灌注后24、48、72小時進行神經(jīng)行為學評分,結(jié)果顯示,ACEA顯著改善3個時間點的神經(jīng)行為學評分(P0.05),AM251在3個時間點均完全逆轉(zhuǎn)ACEA的神經(jīng)保護作用(P0.05),而hemopressin僅僅部分逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng);再灌注后72小時,ACEA明顯減少小鼠海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細胞數(shù)目,降低海馬組織活性caspase-3的表達(P0.05),這一結(jié)果也可以完全被AM251所拮抗(P0.05),但僅被hemopressin部分逆轉(zhuǎn)�！窘Y(jié)論】激活mtCB1受體可以減輕原代海馬神經(jīng)元OGD/R后的神經(jīng)損傷,降低C57BL/6小鼠全腦I/R引起的神經(jīng)元凋亡,改善神經(jīng)功能。實驗三激活mt CB1受體對神經(jīng)元損傷后線粒體功能的保護作用研究【目的】證實激活mt CB1受體對全腦I/R、OGD/R或Ca2+造成線粒體損傷的保護作用�！痉椒ā�(1)激活mt CB1受體對全腦I/R損傷后線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響。18只雄性C57BL/6小鼠被隨機分為6組(n=3):Sham組、BCCAO組、ACEA+BCCAO組、AM251+ACEA+BCCAO組、Hemo+ACEA+BCCAO組和Vehicle+BCCAO組,在再灌注的同時分別腹腔給藥,在再灌注后72小時,對各組小鼠多聚甲醛固定,斷頭取腦,透射電鏡觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元線粒體超微結(jié)構(gòu)變化;(2)激活mt CB1受體對OGD/R損傷后細胞內(nèi)ROS含量及線粒體功能的影響。原代大鼠海馬神經(jīng)元被分為6組(n=6):Control組、OGD組、ACEA+OGD組、AM251+ACEA+OGD組、Hemo+ACEA+OGD組和Vehicle+OGD組,在復氧復糖的同時分別給藥,在復氧復糖后24小時,檢測各組細胞內(nèi)ROS含量;在復氧復糖后2小時和24小時,分別提取各組細胞的線粒體,檢測線粒體呼吸鏈復合體I、II和IV活性及膜電位。(3)激活mt CB1受體對Ca2+誘導線粒體損傷后線粒體功能的影響。將從正常原代大鼠海馬神經(jīng)元分離純化出的線粒體分為5組(n=6),Control組、Ca2+損傷組、0.1μM ACEA+Ca2+損傷組、1μM ACEA+Ca2+損傷組和10μM ACEA+Ca2+損傷組,在Ca2+加入前30分鐘給予ACEA處理,在Ca2+加入后20分鐘,分別檢測各組線粒體的腫脹程度及膜電位�！窘Y(jié)果】(1)激活mt CB1受體改善全腦I/R損傷后線粒體超微結(jié)構(gòu)。Sham組的線粒體呈桿狀或球狀,外膜光滑平整,線粒體嵴排列整齊,結(jié)構(gòu)完整;BCCAO組、AM251+ACEA+BCCAO組和Vehicle+BCCAO組的線粒體結(jié)構(gòu)完全被破壞,線粒體腫脹,內(nèi)部空泡化,嵴排列紊亂;ACEA+BCCAO組和Hemo+ACEA+BCCAO組的線粒體結(jié)構(gòu)基本完整,但有少量空泡化,線粒體嵴有輕微斷裂;(2)激活mt CB1受體降低OGD/R損傷后神經(jīng)元內(nèi)ROS的含量,改善線粒體呼吸鏈復合體活性,增加線粒體膜電位。在復氧復糖后24小時,ACEA顯著降低神經(jīng)元內(nèi)ROS的產(chǎn)生(P0.05),AM251能夠完全逆轉(zhuǎn)這一結(jié)果,而hemopressin僅部分逆轉(zhuǎn);在復氧復糖后2小時和24小時,ACEA可以改善OGD/R損傷后復合體I和IV的活性,增加膜電位(P0.05),卻沒有增加復合體II的活性,Hemo+ACEA也可改善復合體I和IV的活性,增加膜電位(P0.05),也同樣對復合體II的活性沒有影響;(3)激活mt CB1受體減輕Ca2+誘導損傷后線粒體腫脹,增加線粒體膜電位。Ca2+可以顯著誘導純化的線粒體腫脹,降低其膜電位,而通過給予ACEA直接激活mt CB1受體可以改善Ca2+誘導的線粒體損傷(P0.05)�！窘Y(jié)論】激活mt CB1受體可以改善全腦I/R損傷后線粒體超微結(jié)構(gòu),調(diào)節(jié)原代海馬神經(jīng)元OGD/R后的線粒體功能,減輕Ca2+誘導的線粒體腫脹,增加線粒體膜電位水平。實驗四線粒體功能在mt CB1受體神經(jīng)保護中的作用研究【目的】探討激活mt CB1受體是否通過改善線粒體功能誘導神經(jīng)保護作用�！痉椒ā�(1)線粒體呼吸鏈在mt CB1受體神經(jīng)保護中的作用。原代大鼠海馬神經(jīng)元被分為5組:Control組、OGD組、ACEA+OGD組、線粒體復合體I抑制劑rotenone+ACEA+OGD組和線粒體復合體II抑制劑TTFA+ACEA+OGD組,在復氧復糖同時給藥,在復氧復糖后24小時,分別檢測各組細胞的細胞活性(n=8)和乳酸脫氫酶(LDH)釋放量(n=6);(2)激活mt CB1受體對OGD/R損傷后線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(m PTP)開放的影響。原代大鼠海馬神經(jīng)元被分為4組(n=5):Control組、OGD組、ACEA+OGD組和m PTP開放劑蒼術(shù)苷(Atr)+ACEA+OGD組,在復氧復糖同時給藥,在復氧復糖后2小時,分別檢測各組細胞的細胞質(zhì)和線粒體內(nèi)細胞色素C(Cyto C)及細胞核和線粒體內(nèi)凋亡誘導因子(AIF)的含量;(3)m PTP在mt CB1受體神經(jīng)保護中的作用。在體外實驗,原代大鼠海馬神經(jīng)元被分為4組:Control組、OGD組、ACEA+OGD組和Atr+ACEA+OGD組,在復氧復糖的同時給藥,在復氧復糖后24小時,分別檢測各組細胞的細胞活性(n=8)、LDH釋放量(n=6)和流式細胞凋亡率(n=5);在體內(nèi)試驗,40只雄性C57BL/6小鼠被隨機分為4組(n=10):Sham組、BCCAO組、ACEA+BCCAO組和Atr+ACEA+BCCAO組,在再灌注前5分鐘給予腦室注射蒼術(shù)苷(Atr),在再灌注的同時給予腹腔注射ACEA,在再灌注后的24、48和72小時,分別評估各組小鼠神經(jīng)行為學評分;最后一次評估后(再灌注后72小時),對各組小鼠斷頭取腦,TUNEL檢測海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡率(n=5);Western blot檢測海馬組織凋亡蛋白表達水平(n=5)�！窘Y(jié)果】(1)線粒體復合體抑制劑對mt CB1受體神經(jīng)保護作用的影響。在復氧復糖后24小時,ACEA激活mt CB1誘導的神經(jīng)元活性增加,LDH釋放量減少能夠被線粒體復合體I抑制劑rotenone部分逆轉(zhuǎn)(P0.05),而不能被線粒體復合體II抑制劑TTFA所逆轉(zhuǎn);(2)激活mt CB1受體抑制線粒體細胞色素C釋放和凋亡誘導因子(AIF)的細胞核轉(zhuǎn)位。在復氧復糖后2小時,檢測線粒體及去除線粒體后胞質(zhì)中細胞色素C的含量,檢測線粒體及細胞核中AIF的含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),OGD/R損傷后線粒體細胞色素C釋放和AIF的細胞核轉(zhuǎn)位增加,ACEA可以明顯阻斷這一效應(yīng)(P0.05),而給予蒼術(shù)苷(Atr)可以逆轉(zhuǎn)ACEA的作用(P0.05);(3)激活mt CB1受體通過抑制m PTP開放減輕OGD/R和全腦I/R損傷。在復氧復糖后24小時,ACEA顯著增加神經(jīng)元活性,減少LDH釋放量,降低神經(jīng)元凋亡率(P0.05),而給予蒼術(shù)苷(Atr)可以部分逆轉(zhuǎn)ACEA的神經(jīng)保護作用(P0.05);在再灌注后24、48、72小時,ACEA顯著改善3個時間點的神經(jīng)行為學評分(P0.05),在再灌注后72小時,ACEA明顯減少海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細胞數(shù)目,降低海馬組織活性caspase-3的表達(P0.05),給予蒼術(shù)苷(Atr)可以部分逆轉(zhuǎn)ACEA的神經(jīng)保護作用(P0.05)�！窘Y(jié)論】通過抑制線粒體復合體活性或增加m PTP的開放可以部分逆轉(zhuǎn)激活mt CB1受體的神經(jīng)保護作用,進一步證實mt CB1受體的神經(jīng)保護作用與改善線粒體功能密切相關(guān)�！拘〗Y(jié)】上述研究結(jié)果表明,通過給予透膜的選擇性CB1受體激動劑ACEA和非透膜的選擇性CB1受體拮抗劑hemopressin可以選擇性激活mt CB1受體,誘導神經(jīng)保護作用;其機制是通過改善線粒體呼吸鏈復合體活性,增加線粒體膜電位,并通過抑制神經(jīng)元損傷后線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(m PTP)的開放,進一步減少線粒體內(nèi)凋亡相關(guān)因子的釋放和轉(zhuǎn)位,抑制神經(jīng)細胞凋亡。對mt CB1受體神經(jīng)保護效應(yīng)及機制的研究,為大麻素神經(jīng)保護機制提供新的理論依據(jù),也可能避免廣泛激活CB1受體帶來的成癮、精神癥狀等副作用,為臨床腦缺血再灌注損傷防治提供一種新的潛在的干預靶點。
【關(guān)鍵詞】：大麻素CB1受體 線粒體 全腦缺血 神經(jīng)保護 線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R541.78;R743
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-14
• 英文摘要14-21
• 前言21-23
• 文獻回顧23-38
• 實驗一 選擇性激活mtCB1 受體38-58
• 1 材料38-41
• 2 方法41-50
• 3 結(jié)果50-56
• 4 討論56-58
• 實驗二 激活mtCB1 受體的神經(jīng)保護作用研究58-68
• 1 材料58-60
• 2 方法60-63
• 3 結(jié)果63-66
• 4 討論66-68
• 實驗三 激活mtCB1 受體對神經(jīng)元損傷后線粒體功能的保護作用研究68-80
• 1 材料68-70
• 2 方法70-74
• 3 結(jié)果74-78
• 4 討論78-80
• 實驗四 線粒體功能在mtCB1 受體神經(jīng)保護中的作用研究80-93
• 1 材料80-82
• 2 方法82-86
• 3 結(jié)果86-92
• 4 討論92-93
• 小結(jié)93-95
• 參考文獻95-111
• 個人簡歷和研究成果111-113
• 致謝113

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本文編號：585799