本文關(guān)鍵詞：活性氧簇和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在艱難梭菌毒素B誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡中的作用

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【摘要】：艱難梭菌是一種革蘭氏陽性的人類腸道正常菌群,在腸道菌群失衡時(尤其在抗生素濫用的背景下),是住院性腹瀉和偽膜性腸炎的主要致病菌。在過去十幾年中,由于超毒力菌株的出現(xiàn),艱難梭菌感染(Clostridium difficile infection,CDI)的發(fā)病率和死亡率顯著增加。毒素A(Tcd A)和毒素B(Tcd B)是艱難梭菌的兩個主要毒力因子,具有相似的作用機(jī)制,二者的致炎和致凋亡作用已經(jīng)被廣泛報道。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),重組的Tcd B(r Tcd B)可以在結(jié)腸癌細(xì)胞系CT26中誘導(dǎo)免疫原性細(xì)胞死亡(immunogenic cell death,ICD)。ICD是一種近年來提出的新的死亡模式,主要特征是瀕臨死亡的腫瘤細(xì)胞會釋放或表面表達(dá)一些可以激活機(jī)體免疫系統(tǒng)的死亡相關(guān)損傷因子(deth association molecular patterns,DAMPs),從而誘導(dǎo)抗腫瘤抗原的免疫效應(yīng)。目前只有少數(shù)幾種臨床上成功應(yīng)用的抗腫瘤藥物具有刺激ICD的作用,而且研究發(fā)現(xiàn)活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)在調(diào)控瀕死癌細(xì)胞的免疫原性和幾種關(guān)鍵DAMPs釋放的通路中發(fā)揮重要作用。雖然對Tcd A和Tcd B的毒性機(jī)制的研究已經(jīng)有了很大進(jìn)展,但關(guān)于其誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的機(jī)制卻存在很多爭議,是否ROS和ER stress參與其中也無系統(tǒng)報道。本文主要檢測了ROS和ER stress在r Tcd B中毒細(xì)胞中的發(fā)生情況,并研究了它們在r Tcd B誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中的作用。研究結(jié)果表明,在CT26細(xì)胞中r Tcd B誘導(dǎo)的ROS增加不依賴于毒素濃度,胞內(nèi)的ROS在毒素(100 ng/m L)處理后的24小時內(nèi)處于動態(tài)變化中。三種ROS的藥理學(xué)抑制劑N-乙酰半胱氨酸(NAC,使用濃度5 m M)、二甲基碘苯翁(DPI,使用濃度5μM)和抗霉素A(Antimycin A,使用濃度5μM)不僅可以顯著抑制r Tcd B誘導(dǎo)的PS膜外表達(dá)和sub-G1期細(xì)胞含量,也顯著抑制了因r Tcd B處理引起的Bcl-2蛋白表達(dá)的減少和磷酸化STAT3蛋白表達(dá)的增加,說明ROS通過調(diào)控Bcl-2和磷酸化STAT3蛋白表達(dá)參與r Tcd B誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。此外,r Tcd B也可以在人類結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-8中誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生。NAC通過抑制胞內(nèi)ROS產(chǎn)生、抵抗線粒體膜電位改變、抑制Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)和抑制自噬蛋白LC3B(Light Chain 3 B isoforms)的轉(zhuǎn)歸保護(hù)r Tcd B中毒的細(xì)胞。ER stress的兩條關(guān)鍵的未折疊蛋白反應(yīng)支路—PERK和IRE1α支路在r Tcd B中毒的CT26細(xì)胞中被活化。然而,葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶雙位點突變的Tcd B也可以在CT26細(xì)胞中誘導(dǎo)這兩條支路的活化,說明rTcd B對ER stress的誘導(dǎo)不依賴于毒素的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性的。此外,r Tcd B并不影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑關(guān)鍵蛋白CHOP(C/EBP-homologous protein)的表達(dá),相反,突變毒素B可以誘導(dǎo)它上調(diào),說明CHOP蛋白的表達(dá)受到葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶或其下游的Rho蛋白活性的調(diào)控。Salubrinal是一種特異性的e IF2α(α-subunit of eukaryotic translational initiation factor 2)蛋白脫磷酸化抑制劑,研究發(fā)現(xiàn)它通過抑制caspase 9活化和自噬、影響Rac1蛋白的葡萄糖基化來保護(hù)r Tcd B中毒的細(xì)胞。綜上,由rTcd B在CT26細(xì)胞中誘導(dǎo)的ER stress并不參與最終的細(xì)胞死亡,它更可能是對抗r Tcd B中毒的一種保護(hù)機(jī)制。動物實驗結(jié)果表明,經(jīng)活細(xì)胞challenge后,用r Tcd B(500 ng/m L)處理6小時的細(xì)胞免疫的小鼠沒有腫瘤生長。用ER stress藥理學(xué)抑制劑(TUDCA(tauroursodeoxycholic acid)或4-PBA(4-phenylbuturate))與r Tcd B共處理6小時的細(xì)胞免疫的小鼠也沒有腫瘤生長,說明ER stress不參與r Tcd B誘導(dǎo)的ICD。用DPI或Anti.A與r Tcd B共處理的CT26細(xì)胞免疫的小鼠在challenge后部分長出了腫瘤,但用NAC與r Tcd B共處理細(xì)胞接種的小鼠并無腫瘤生長,這可能與NAC是在ROS產(chǎn)生后才發(fā)揮清除作用,而DPI和Anit.A則直接從源頭上抑制ROS產(chǎn)生有關(guān)。對HSP90、HSP70和HMGB1蛋白胞外表達(dá)、鈣網(wǎng)織蛋白(CRT)質(zhì)膜表達(dá)、自噬蛋白LC3B表達(dá)以及胞內(nèi)外ATP含量的檢測結(jié)果表明,DPI和Anti.A顯著抑制了r Tcd B誘導(dǎo)的三種蛋白的胞外分泌和CRT質(zhì)膜表達(dá),但NAC對它們的影響有限。三種抑制劑均顯著抑制了自噬蛋白LC3B的轉(zhuǎn)歸,但并不影響ATP的胞外分泌。由以上數(shù)據(jù)可知,ROS可以通過抑制關(guān)鍵DAMPs的分泌或位移(HSP90、HSP70、HMGB1和鈣網(wǎng)織蛋白)以及影響自噬來影響ICD。綜上所述,本研究證明rTcd B處理導(dǎo)致了胞內(nèi)ROS的增加和ER stress的發(fā)生,ROS參與rTcd B誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和ICD,但ER stress并不參與這兩種細(xì)胞死亡形式。
【關(guān)鍵詞】：艱難梭菌毒素B 活性氧簇 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 細(xì)胞死亡 免疫原性細(xì)胞死亡
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.2
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 中英文對照和縮略詞表14-16
• 第一章 緒論16-28
• 1.1 艱難梭菌及其致病機(jī)制16-19
• 1.1.1 艱難梭菌簡介及其感染現(xiàn)狀16-17
• 1.1.2 艱難梭菌的致病因子17-18
• 1.1.3 毒素A和毒素B的作用機(jī)制18-19
• 1.2 細(xì)胞死亡及其研究進(jìn)展19-24
• 1.2.1 細(xì)胞凋亡20-21
• 1.2.2 自噬21-22
• 1.2.3 免疫原性細(xì)胞死亡（Immunogenic cell death，ICD）22-23
• 1.2.4 壞死23-24
• 1.3 艱難梭菌毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡24-25
• 1.4 本課題的研究目的、意義與主要內(nèi)容25-28
• 1.4.1 研究目的25
• 1.4.2 研究意義25-26
• 1.4.3 主要研究內(nèi)容26-28
• 第二章 活性氧簇在TcdB誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用28-56
• 2.1 引言28-29
• 2.2 實驗材料29-34
• 2.2.1 細(xì)胞和毒素29
• 2.2.2 主要設(shè)備與耗材29-30
• 2.2.3 主要藥品與試劑30-31
• 2.2.4 主要實驗用溶液配制31-34
• 2.3 實驗方法34-43
• 2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)34
• 2.3.2 細(xì)胞復(fù)蘇34-35
• 2.3.3 細(xì)胞傳代35
• 2.3.4 細(xì)胞凍存35
• 2.3.5 重組艱難梭菌毒素B的表達(dá)純化35-36
• 2.3.6 親和層析純化蛋白36-37
• 2.3.7 細(xì)胞病變效應(yīng)及細(xì)胞毒性檢測37
• 2.3.8 細(xì)胞內(nèi)活性氧的檢測37
• 2.3.9 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡37-38
• 2.3.10 Sub-G1 法檢測細(xì)胞凋亡38-39
• 2.3.11 DNA ladder39-40
• 2.3.12 Western blot40-42
• 2.3.13 羅丹明檢測胞內(nèi)線粒體膜電位的改變42-43
• 2.4 結(jié)果與討論43-55
• 2.4.1 重組艱難梭菌毒素B(rTcdB)的表達(dá)純化及其性質(zhì)鑒定43-46
• 2.4.2 rTcdB處理誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的水平升高46-47
• 2.4.3 ROS參與r TcdB引起的細(xì)胞凋亡47-50
• 2.4.4 NAC保護(hù)艱難梭菌毒素B引起的細(xì)胞死亡效應(yīng)的機(jī)制50-55
• 2.5 小結(jié)55-56
• 第三章 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在TcdB誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用56-80
• 3.1 引言56-57
• 3.2 實驗材料57-59
• 3.2.1 細(xì)胞和毒素57
• 3.2.2 主要設(shè)備及耗材57
• 3.2.3 主要試劑57-58
• 3.2.4 主要溶液配制58
• 3.2.5 引物58-59
• 3.3 實驗方法59-64
• 3.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)、傳代、復(fù)蘇及凍存方法59
• 3.3.2 重組突變毒素B（mrTcdB）的表達(dá)純化59
• 3.3.3 實時定量PCR （Real-time PCR）59-61
• 3.3.4 逆轉(zhuǎn)錄PCR61-62
• 3.3.5 Western Blot檢測蛋白表達(dá)62
• 3.3.6 細(xì)胞凋亡檢測62
• 3.3.7 細(xì)胞病變和細(xì)胞毒性效應(yīng)62-63
• 3.3.8 乳酸脫氫酶（LDH）測試63-64
• 3.4 結(jié)果與討論64-78
• 3.4.1 重組突變毒素B（mrTcdB）的表達(dá)、純化與細(xì)胞毒性和病變效應(yīng)測定64-65
• 3.4.2 rTcd B 誘導(dǎo) ER stress65-68
• 3.4.3 艱難梭菌毒素B對凋亡性ER stress分子標(biāo)記物的影響68-71
• 3.4.4 rTcdB引起的ER stress是葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶非依賴的71-72
• 3.4.5 Salubrinal對rTcdB中毒細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)及其機(jī)制研究72-78
• 3.5 小結(jié)78-80
• 第四章 ROS和ER stress在TcdB誘導(dǎo)的免疫原性細(xì)胞死亡中的作用80-96
• 4.1 引言80-84
• 4.1.1 ICD相關(guān)DAMPs簡介80-83
• 4.1.2 ICD誘導(dǎo)劑83-84
• 4.2 實驗材料84-85
• 4.2.1 細(xì)胞和毒素84
• 4.2.2 主要試劑84-85
• 4.2.3 主要實驗用試劑配制85
• 4.2.4 主要儀器85
• 4.3 主要實驗方法85-89
• 4.3.1 Western blot檢測上清和全細(xì)胞蛋白85-86
• 4.3.2 細(xì)胞凋亡狀態(tài)分析86-87
• 4.3.3 CRT膜轉(zhuǎn)位分析87-88
• 4.3.4 小鼠免疫模型的建立88-89
• 4.4 結(jié)果和討論89-95
• 4.4.1 ROS和ER stress對r TcdB中毒的CT26 細(xì)胞凋亡的影響89-90
• 4.4.2 ROS和ER stress在r TcdB中毒的CT26 細(xì)胞腫瘤免疫模型中的作用90-93
• 4.4.3 ROS影響r TcdB在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)的ICD的相關(guān)機(jī)制93-95
• 4.5 小結(jié)95-96
• 結(jié)論與展望96-98
• 結(jié)論96
• 論文創(chuàng)新點96
• 展望96-98
• 參考文獻(xiàn)98-113
• 攻讀博士學(xué)位期間取得的研究成果113-114
• 致謝114-115
• 附件115

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;Clostridium difficile infections in China[J];Journal of Biomedical Research;2010年06期

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本文編號：563876