發(fā)布時(shí)間：2017-07-05 23:06

  本文關(guān)鍵詞：ADAMTS-5在腰椎軟骨終板退變中的表達(dá)變化及其機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 聚蛋白聚糖酶 腰椎退變 軟骨終板 IL-1β NF-κB ADAMTS-5

【摘要】：研究背景和目的慢性下腰痛是目前最常見的疾病之一,并成為致殘的重要原因。它已造成極大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。慢性下腰痛的主要原因是椎間盤退變。作為最大的無血管器官,髓核和內(nèi)層纖維環(huán)所需的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)是通過軟骨終板(CEP)的擴(kuò)散提供的。軟骨終板是位于椎間盤上下緣薄薄一層厚度小于1毫米軟骨,在脊柱局部的生物力學(xué)和生化功能中扮演非常重要的角色。軟骨終板的退行性變可導(dǎo)致低養(yǎng)分供應(yīng)、低氧張力、乳酸堆積,從而誘導(dǎo)椎間盤變性。因此,軟骨終板退變與椎間盤變性和下腰痛息息相關(guān)。椎體終板及軟骨下骨在磁共振成像(MRI)上信號(hào)強(qiáng)度的變化是脊柱退行性疾病中的一種常見現(xiàn)象。1988年,Modic總結(jié)了這些變化,稱他們?yōu)镸odic改變(Modic changes, MCs),并分為三種類型。Ⅰ型,在T1加權(quán)像上顯示為低信號(hào),T2加權(quán)像上相對正常終板顯示為高信號(hào),組織病理學(xué)表現(xiàn)為組織水腫和血管化增加；Ⅱ型,在T1加權(quán)像上為高信號(hào),T2加權(quán)像上表現(xiàn)為等信號(hào)或輕度高信號(hào),組織病理學(xué)表現(xiàn)為紅骨髓被黃骨髓取代；Ⅲ型,在T1加權(quán)像及T2加權(quán)像上均表現(xiàn)為低信號(hào),組織病理學(xué)表現(xiàn)為骨質(zhì)硬化。盡管Modic改變的原因和病理生理學(xué)尚不清楚,但是多數(shù)學(xué)者認(rèn)為炎癥介質(zhì)可能在軟骨終板退化中起著重要的作用。Crock認(rèn)為髓核中的炎癥因子彌漫可能導(dǎo)致軟骨終板的炎癥反應(yīng),從而繼發(fā)退變。在兩個(gè)臨床研究中發(fā)現(xiàn),化學(xué)髓核溶解術(shù)后鄰近終板發(fā)生了Modic改變。Ohtori等發(fā)現(xiàn),腫瘤壞死因子(TNF)陽性的免疫反應(yīng)性細(xì)胞在伴有Modic改變的軟骨終板明顯比MRI正常的軟骨終板多。然而,到目前為止,關(guān)于軟骨終板變性的炎癥機(jī)制的研究還很少。軟骨細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的2種主要成分是膠原蛋白和蛋白多糖(PG)。膠原蛋白是一種框架蛋白,而PG保持滲透性腫脹和控制溶質(zhì)運(yùn)輸。軟骨終板中的蛋白多糖(PG)主要類型是聚蛋白聚糖,它與連接蛋白和透明質(zhì)酸一起形成大型復(fù)合物,能夠填補(bǔ)膠原蛋白網(wǎng)的空隙。聚蛋白聚糖的核心蛋白質(zhì)折疊成三個(gè)球狀域：G1,G2和G3。聚蛋白聚糖的糖胺聚糖側(cè)鏈位于G2和G3之間,主要由硫酸軟骨素和角質(zhì)素構(gòu)成,帶負(fù)電荷并保持水分,使其具有抗壓能力。有學(xué)者認(rèn)為,軟骨終板變性與聚蛋白聚糖和II型膠原蛋白進(jìn)行性的丟失有關(guān)。聚蛋白聚糖的丟失是軟骨損傷最早的表現(xiàn)形式。負(fù)責(zé)降解聚蛋白聚糖的核心蛋白有兩種主要的降解酶：基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和聚蛋白聚糖酶�；|(zhì)金屬蛋白酶已被證實(shí)能夠降解蛋白聚糖和膠原蛋白,以及纖連蛋白。多個(gè)研究表明,在動(dòng)物模型和體外軟骨組織中降解聚蛋白聚糖的主要酶是聚蛋白聚糖酶-1和2,也稱為ADAMTS-4(a disintegrin-like and metalloprotease with thrombospondin type I motifs,4)和DAMTS-5。n端的前兩個(gè)域G1和G2由128-氨基酸組成的短多肽連接,被稱為蛋白聚糖球域(IGD)。已經(jīng)觀察到導(dǎo)致聚蛋白聚糖從軟骨組織消耗的主要切割位點(diǎn)在蛋白聚糖球域(IGD)。因?yàn)檫@個(gè)原因?qū)е戮鄣鞍拙厶侨笔1結(jié)構(gòu)域,并從軟骨的矩陣結(jié)構(gòu)中游離出來而不能促成軟骨的功能。在蛋白聚糖球域(IGD)中,兩個(gè)主要的蛋白酶切的位點(diǎn)已確定：一個(gè)在Asn341-Phe342,被基質(zhì)金屬蛋白酶作用,另外一個(gè)在Glu373-Ala374,被ADAMTS作用。聚蛋白聚糖酶負(fù)責(zé)軟骨重塑早期變化中的聚蛋白聚糖的裂解。聚蛋白聚糖缺失后,膠原纖維就暴露出來被基質(zhì)金屬蛋白酶切割。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)通過降解膠原蛋白參與軟骨重塑的進(jìn)展階段。聚蛋白聚糖的合成和降解是一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡,來維持軟骨終板(CEP)的生理功能。嚴(yán)格調(diào)控這些聚蛋白聚糖酶的活性對維持這種平衡是至關(guān)重要的。雖然已報(bào)道在退變的關(guān)節(jié)軟骨和髓核中ADAMTS-4和ADAMTS-5的表達(dá)水平比沒有退變組有顯著升高。這些基質(zhì)酶基因表達(dá)的細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)制還沒有很好地被解釋。聚蛋白聚糖酶在人的軟骨細(xì)胞和髓核細(xì)胞中被促炎細(xì)胞因子,如白細(xì)胞介素1β和腫瘤壞死因子α等上調(diào)。核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族,在介導(dǎo)對損傷、應(yīng)激和炎癥的細(xì)胞反應(yīng)中起著核心作用。NF-κB是關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和髓核細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和聚蛋白聚糖酶表達(dá)調(diào)控的一個(gè)至關(guān)重要的途徑。盡管多項(xiàng)研究已經(jīng)關(guān)注聚蛋白聚糖酶在退變關(guān)節(jié)軟骨和髓核的作用和相關(guān)調(diào)控機(jī)制,但在軟骨終板仍幾乎沒有報(bào)道。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn),在伴Modic改變的軟骨終板中,退變相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)與ADAMTS-5表達(dá)水平增加相關(guān),但與ADAMTS-4沒有關(guān)聯(lián)。并證實(shí),在培養(yǎng)的牛終板軟骨細(xì)胞中TNF-α可以通tNF-κB途徑刺激ADAMT S-5的表達(dá)。IL-1p對人的軟骨終板的ADAMTS-4或ADAMTS-5表達(dá)的影響,及相關(guān)機(jī)制尚未見報(bào)道�；谏鲜龅挠^察,我們假設(shè)IL-1p參與軟骨終板退變中ADAMTS-5的表達(dá),且通過NF-κB途徑上調(diào)終板軟骨細(xì)胞的ADAMTS-5表達(dá)。通過以下實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)：分析伴Modic改變的人腰椎軟骨終板中ADAMTS-5的表達(dá)水平及其與IL-1β表達(dá)的相關(guān)性；通過牛終板軟骨細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn),研究IL-1p對終板軟骨細(xì)胞的ADAMTS-5表達(dá)的刺激作用,及其調(diào)控機(jī)制。方法1.使用geNorm、NormFinder和BestKeeper三種軟件篩選出在Modic改變(MCs)腰椎軟骨終板細(xì)胞中表達(dá)最為穩(wěn)定的管家基因作為內(nèi)參,對qRT-PCR進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。所有腰椎軟骨標(biāo)本選自各種腰椎疾患而行椎體間融合術(shù)的患者。軟骨終板有MCs的患者納入到MCs組,沒有MCs的歸為對照組。MCs組和對照組分別有來自12個(gè)患者的樣本。兩組間患者的的年齡、性別相匹配,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。從既往文獻(xiàn)中常用的管家基因及關(guān)于骨性關(guān)節(jié)炎軟骨的基因芯片表達(dá)數(shù)據(jù)中選取12個(gè)備選基因。終板軟骨的RNA提取依照Untergasser所述方法進(jìn)行操作。逆轉(zhuǎn)錄采用Reverse TRanscription System試劑盒Reverse Transcription System。qRT-PCR采用GoTaq qRCP Master Mix試劑盒操作完成。每個(gè)樣本Ct值的數(shù)據(jù)分析采用3個(gè)基于微軟Excel平臺(tái)的宏程序：即geNorm, NormFinder和BestKeeper。這些統(tǒng)計(jì)算法被用來評估12個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性,并確定Modic改變腰椎軟骨終板細(xì)胞中最適合作內(nèi)參的管家基因,對qRT-PCR進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。2.確定腰椎軟骨終板退變中ADAMTS-5表達(dá)的變化及其與IL-1p的相關(guān)性所有腰椎退行性軟骨終板標(biāo)本選自因伴Modic改變的下腰痛疾患而行椎體間融合術(shù)的患者,納入到MCs組。沒有下腰痛病史而因胸腰椎爆裂性骨折需病椎和相鄰椎間盤切除并植骨重建的患者納入到對照組。組織學(xué)分析伴Modic改變的軟骨終板(CEP)中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)的變化。RNA提取和qRT-PCR技術(shù)分析軟骨組織退變相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)、ADAMTS和IL-1β的mRNA在MCs組和對照組兩者間的表達(dá)差異。免疫組織化學(xué)方法研究兩組CEP中ADAMTS-4,ADAMTS-5和IL-1p各自的免疫反應(yīng)陽性的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。用Spearman相關(guān)系數(shù)(Spearman p test)方法,從mRNA表達(dá)及免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞的百分率兩個(gè)方面,分析腰椎軟骨終板退變中ADAMTS-5表達(dá)與IL-1p之間的相關(guān)性。3.通過牛終板軟骨細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn),明確IL-1p能促進(jìn)終板軟骨細(xì)胞ADAMTS-5表達(dá),并通過NF-κB信號(hào)通路來調(diào)控ADAMTS-5的表達(dá)用qRT-PCR技術(shù),免疫細(xì)胞化學(xué)方法,Western Blot等多種分子生物技術(shù),檢測IL-1p對牛終板軟骨細(xì)胞中ADAMTS-5表達(dá)的刺激效應(yīng)。應(yīng)用Western Blot分析IL-1p對牛終板軟骨細(xì)胞的NF-κB信號(hào)通路的激活作用。并通過應(yīng)用NF-κB抑制劑SN50阻斷IL-1β對牛終板軟骨細(xì)胞ADAMTS-5表達(dá)的刺激,反向證實(shí)IL-1β通過NF-κB信號(hào)通路上調(diào)ADAMTS-5的表達(dá)。結(jié)果1.12個(gè)備選內(nèi)參基因的Ct值范圍為從17.6 (18S rRNA)到33.5 (ACTB).在GeNorm分析中,M值最小的為SDHA和B2M(0.45),因此它們是表達(dá)水平最穩(wěn)定的兩個(gè)基因。按照表達(dá)水平穩(wěn)定性從最高到最低進(jìn)行排序,具體順序?yàn)镾DHA= B2MLDHATBPGUSBGAPDHIPO8HMBSACTBHPRT118S rRNARPL13A.在NormFinder分析中,所有樣本中最穩(wěn)定的基因是LDHA,其M值為0.102,隨后依次為SDHA、B2M、GUSB、GAPDH、IPO8、HMBS、ACTB、 TBP、18S rRNA、HPRT1和RPL13A.在BestKeeper分析中,SDHA和ACTB的CV±SD值最小,因此被認(rèn)為是所有樣本中表達(dá)最穩(wěn)定的兩個(gè)基因。SDHA是所有樣本中表達(dá)最穩(wěn)定的單個(gè)基因,而SDHA、B2M和LDHA則是最佳的聯(lián)合內(nèi)參基因選擇。2.MCs組表現(xiàn)為軟骨細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)纖維化、硬化,以及軟骨細(xì)胞密度顯著降低。 并可觀察到細(xì)胞肥大、集群和呈現(xiàn)多種細(xì)胞形態(tài)。番紅O-固綠染色顯示MCs組PG含量明顯減少。細(xì)胞外基質(zhì)的基因表達(dá)水平的qRT-PCR檢測中,MC組的II型膠原的mRNA表達(dá)水平較對照組明顯降低(P0.05)；MC組中ADAMTS-5mRNA表達(dá)與對照組相比顯著增加(P0.05)。免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示,MC組ADAMTS-5免疫檢測陽性的細(xì)胞百分比明顯高于對照組(P0.01)。而MC組中ADAMTS-4mRNA表達(dá)水平和免疫檢測陽性的細(xì)胞百分率只較對照組稍微增加而無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在mRNA表達(dá)及免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞的百分率兩個(gè)方面,Spearman相關(guān)系數(shù)(Spearman p test)分析均證實(shí)腰椎軟骨終板退變中IL-1p表達(dá)增強(qiáng)與ADAMTS-5高水平表達(dá)之間呈正相關(guān)。3.IL-1β能上調(diào)牛終板軟骨細(xì)胞的ADAMTS-5的mRNA和蛋白表達(dá)水平。經(jīng)IL-1β(10 ng/mL)作用48小時(shí)后,RT-PCR和Western Blot分別顯示牛終板軟骨細(xì)胞ADAMTS-5的]mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著增加(P0.01)。免疫細(xì)胞化學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)IL-1p作用以后,ADAMTS-5蛋白陽性的牛終板軟骨細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞內(nèi)ADAMTS-5蛋白的熒光強(qiáng)度較與對照組顯著增強(qiáng)。在(10ng/mL) IL-1β作用15min后,牛終板軟骨細(xì)胞的p-p65的蛋白濃度明顯升高,IκB-α的蛋白濃度明顯降低,而p65在始終基本保持不變。IL-1p對牛終板軟骨細(xì)胞ADAMTS-5表達(dá)的刺激作用可以被NF-κB抑制劑SN50(50微克／毫升)有效阻斷。結(jié)論1.這是第一個(gè)為確保腰椎終板軟骨細(xì)胞中基因表達(dá)水平評估的可靠性而選擇合適內(nèi)參基因的研究。我們的研究發(fā)現(xiàn)在所有樣本中,表達(dá)最穩(wěn)定的基因是SDHA,聯(lián)合采用SDHA、B2M和LDHA作為內(nèi)參基因,可以獲得更為精準(zhǔn)的結(jié)果。2.伴Modic改變的腰椎終板軟骨細(xì)胞中ADAMTS-5mRNA表達(dá)水平較正常軟骨終板有顯著增加,而ADAMTS-4表達(dá)水平無明顯改變。ADAMTS-5mRNA表達(dá)水平與IL-1β表達(dá)呈正相關(guān),提示IL-1β可能選擇性地上調(diào)終板軟骨細(xì)胞ADAMTS-5的表達(dá)。3.我們的研究首次證實(shí),IL-1β可以誘導(dǎo)牛終板軟骨細(xì)胞中的ADAMTS-5表達(dá),但不作用于ADAMTS-4。從IL-1β對牛終板軟骨細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的有效激活及NF-κB抑制劑SN50對IL-1p刺激的有效阻斷兩方面證實(shí)IL-1β可通過NF-κB信號(hào)通路上調(diào)終板軟骨細(xì)胞ADAMTS-5的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：聚蛋白聚糖酶 腰椎退變 軟骨終板 IL-1β NF-κB ADAMTS-5
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R681.53
【目錄】：

• 致謝5-6
• 中文摘要6-12
• 英文摘要12-19
• 英文縮寫詞表19-23
• 前言23-34
• 參考文獻(xiàn)28-34
• 第一部分 腰椎軟骨終板退變相關(guān)實(shí)驗(yàn)熒光定量PCR內(nèi)參基因的選擇研究34-56
• 1 引言34-35
• 2 材料與方法35-43
• 3 結(jié)果43-51
• 4 討論51-53
• 參考文獻(xiàn)53-56
• 第二部分 退變軟骨終板中ADAMTS-5表達(dá)的變化及其與IL-1β的相關(guān)性56-78
• 1 引言56-57
• 2 材料與方法57-65
• 3 結(jié)果65-73
• 4 討論73-75
• 參考文獻(xiàn)75-78
• 第三部分 IL-1β經(jīng)NF-κB通路上調(diào)終板軟骨細(xì)胞ADAMTS-5的表達(dá)78-98
• 1 引言78-79
• 2 材料與方法79-86
• 3 結(jié)果86-92
• 4 討論92-95
• 參考文獻(xiàn)95-98
• 文獻(xiàn)綜述98-112
• 參考文獻(xiàn)106-112
• 作者簡歷及在讀期間所取得的科研成果112

，

本文編號(hào)：523910