本文關鍵詞：2-甲氧基雌二醇對脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能、TAU蛋白影響及對急性腦梗死大鼠神經(jīng)功能影響的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)可由外傷、出血、腫瘤壓迫等多因素引起,是臨床工作中常見的神經(jīng)外科疾病,可嚴重影響患者及家屬的生活質量。近年來礦難,重大交通事故,自然災害頻發(fā),脊髓損傷可成批發(fā)生且傷情嚴重復雜,并發(fā)癥多,預后差,甚至造成患者終生殘廢或危及生命。目前治療脊髓損傷常用方法包括手術治療,細胞移植,藥物治療,基因工程等療法,其中藥物治療中激素沖擊療法廣為使用,但因其可發(fā)生較多的副作用而受到限制。早期應用大劑量激素沖擊療法已經(jīng)在脊髓損傷中的神經(jīng)康復作用得到肯定。早期治療脊髓損傷最廣泛應用的藥物代表是地塞米松和甲強龍,得到了廣大臨床工作者的推廣。激素可以減輕細胞水腫、改善血液循環(huán)、抑制炎癥、降低毒性物質的釋放等。但是大劑量激素的應用可能帶來較為嚴重的并發(fā)癥如血糖升高,水電解質紊亂和應激性潰瘍等,因此在臨床上只能短時間沖擊治療。尋找其他藥物替代地塞米松及甲強龍治療脊髓損傷越來越受到臨床醫(yī)生的關注。近年來有報道雌激素及黃體酮對可以改善脊髓損傷大鼠的神經(jīng)功能,但作用機制不明確。我國中醫(yī)中藥治療脊髓損傷也獲得一定療效,尤其是活血化瘀的藥物,但有些藥物缺乏循證醫(yī)學的論證,對于副作用的評價也不完善。2-甲氧基雌二醇(2ME2)是激素雌二醇的天然代謝產(chǎn)物,存在于人體的血液中。目前的研究表明其有一定的抗腫瘤及神經(jīng)保護作用。因其毒性作用小,受到越來越多專家學者的關注。近年來2ME2通過減少神經(jīng)細胞凋亡、減輕神經(jīng)細胞水腫等對缺血缺氧性腦病具有治療作用已經(jīng)得到了廣泛的認可。脊髓損傷也可導致神經(jīng)細胞的變性、壞死；損傷后組織缺血缺氧、內環(huán)境變化及血管內有害物質的聚集可造成脊髓后續(xù)的損害。目前關于2ME2是否對脊髓損傷大鼠具有一定治療作用的相關報道較少。本實驗通過2ME2治療急性脊髓損傷大鼠,檢測脊髓損傷大鼠的運動功能,觀察其治療作用,并探討其可能的機制。Tau蛋白是微管相關蛋白,其主要功能是與微管蛋白結合,維持微管的穩(wěn)定同時誘導微管形成。Tau蛋白誘導與促進微管蛋白聚合成微管,并與新聚合的微管結合在一起,保持微管相互之間的距離,影響神經(jīng)元蛋白激酶的附著點,在神經(jīng)元可塑性方面起重要的作用。目前已證實老年癡呆癥患者的神經(jīng)元中Tau蛋白總量多于正常人,且有功能的Tau蛋白較常人減少。近年來研究發(fā)現(xiàn),腦缺血缺氧性腦病與神經(jīng)細胞內的Tau蛋白含量及磷酸化水平關系密切,Tau蛋白含量增伴隨過度磷酸化可致神經(jīng)元微管結構受破壞,正常軸突轉運受損從而引起神經(jīng)元功能損傷。在脊髓損傷的過程中神經(jīng)細胞也存在微管的損害,但與Tau蛋白及磷酸化水平的變化關系目前研究較少,因此我們希望通過檢測脊髓損傷后組織Tau蛋白及磷酸化Tau蛋白的含量,來探討脊髓損傷與Tau蛋白的關系。Hung KS等發(fā)現(xiàn)大鼠脊髓損傷后Tau蛋白磷酸化水平增加,經(jīng)過治療后Tau蛋白磷酸化水平下降,并提出Tau蛋白磷酸化水平與脊髓損傷的程度正相關。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)2ME2對急性脊髓損傷有治療作用,能改善脊髓損傷大鼠的運動功能,減少神經(jīng)細胞調亡；因此我們希望通過檢測經(jīng)2ME2治療前后Tau蛋白磷酸化水平的變化,探討2ME2治療脊髓損傷可能存在的機制。急性腦梗死在我國發(fā)病率高、致死率高,是嚴重威脅人體健康的疾病類型之一。急性腦梗死發(fā)作時,腦動脈梗阻,腦組織血液供應發(fā)生障礙,導致局部腦組織因缺血缺氧發(fā)生壞死或軟化。但是在梗塞病灶周圍存在可逆的缺血半暗帶區(qū),該區(qū)域的組織在功能上呈現(xiàn)可逆性損害,這部分組織細胞仍呈現(xiàn)正常的組織結構,但在生理功能上存在缺陷,這部份細胞在不利的環(huán)境中可變性死亡,但如果在好的環(huán)境下可以恢復正常功能。目前臨床研究都集中在梗塞周邊的神經(jīng)保護治療。有報道2ME2對腦缺血缺氧具有保護作用,包括抑制神經(jīng)細胞凋亡,減輕神經(jīng)細胞水腫等,對缺血缺氧性腦病具有一定的保護作用。因此本實驗研究2ME2對急性腦梗死大鼠腦組織神經(jīng)的影響,旨在為臨床治療急性腦梗死提供一定的理論依據(jù)。急性腦梗死發(fā)作時,因為缺血缺氧、梗塞后水腫壓迫、自由基聚集、細胞代謝障礙等多種復雜因素導致梗塞周邊神經(jīng)細胞處于凋亡狀態(tài)。而細胞的凋亡則是由基因調控細胞程序性死亡的過程。控制細胞凋亡的基因分為促凋亡基因和抗凋亡基因兩大類。兩類基因的活躍程度決定了神經(jīng)細胞的凋亡。Caspase-3、bcl-2家族、Fas等屬于促凋亡基因,其中caspase-3在神經(jīng)細胞凋亡通路上扮演著重要的角色。Adam Hafeez等在研究大鼠急性腦梗死模型時發(fā)現(xiàn),缺血缺氧可以誘導神經(jīng)細胞的凋亡,導致神經(jīng)元的丟失。并檢測到了大鼠腦梗死周圍組織的caspase-3表達增加。因此我們在實驗中通過TUNEL染色檢測凋亡及檢測caspase-3來驗證2ME2對急性腦梗死的凋亡的影響。第一章 2ME2對脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能及脊髓神經(jīng)細胞凋亡的影響目的：研究激素雌二醇的代謝產(chǎn)物2-甲氧基雌二醇(2ME2)對脊髓損傷(SCI)大鼠神經(jīng)功能及神經(jīng)細胞凋亡的影響。方法：將成年雄性SD大鼠72只隨機分為3組：假手術組(n=24)、脊髓損傷(n=24)和脊髓損傷2ME2治療組(n=24)。采用改良的Allen's法制作脊髓損傷模型。從脊髓損傷大鼠模型建立后第一天開始,脊髓損傷治療組大鼠按24mg/kg給予2ME2腹腔注射,連續(xù)注射7天。脊髓損傷組大鼠給予等劑量生理鹽水腹腔注射,假手術組不給予干預措施。應用BBB評分系統(tǒng)對大鼠第1d,3d,7d,14d,21d,28d后肢運動功能進行評估。第7d應用免疫熒光染色檢測caspase-3表達。第7d通過TUNEL凋亡原位檢測試劑盒檢測神經(jīng)細胞凋亡結果：脊髓損傷組和脊髓損傷2ME2治療組BBB評分明顯低于假手術組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),脊髓損傷2ME2治療組在14d、21d、28d BBB評分明顯高于脊髓損傷組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。說明2ME2可以改善脊髓損傷大鼠的神經(jīng)功能恢復。脊髓損傷組及脊髓損傷2ME2治療組隨著時間的推移,功能在恢復,各個時間點的評分存在差異,具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。免疫熒光染色結果顯示,脊髓損傷組(25.13±3.64)及脊髓損傷治療組(15.89±4.68)caspase-3蛋白表達陽性細胞數(shù)較假手術組(3.32±2.11)顯著增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),脊髓損傷2ME2治療組caspase-3蛋白表達陽性細胞數(shù)較脊髓損傷組顯著減少,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(個/高倍視野,×400)。TUNEL染色觀察脊髓神經(jīng)組織細胞凋亡顯示：與假手術組(2.05±1.54)相比,脊髓損傷組(40.62±5.02)及脊髓損傷2ME2治療組(18.79.62±3.28)凋亡細胞數(shù)顯著增多,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),脊髓損傷2ME2治療組凋亡細胞指數(shù)較脊髓損傷組顯著減低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。證明2ME2可以改善神經(jīng)功能,抑制神經(jīng)細胞凋亡。結論：2ME2改善脊髓損傷大鼠模型脊髓損后的運動功能,具有神經(jīng)保護作用；2ME2降低脊髓損傷大鼠模型脊髓損后caspase-3蛋白表達,抑制神經(jīng)細胞凋亡。第二章脊髓損傷大鼠TAU蛋白的變化及2ME2對TAU蛋白磷酸化的影響目的：通過檢測脊髓損傷(SCI)后脊髓組織Tau蛋白的變化,并檢測SCI2ME2治療脊髓損傷大鼠前后脊髓組織Tau蛋白磷酸化水平的變化；探討脊髓損傷與Tau蛋白的關系及2ME2治療脊髓損與Tau蛋白磷酸化的關系。方法：將成年雄性SD大鼠72只隨機分為假手術組(Il=24)、脊髓損傷組(n=24)和脊髓損傷2ME2治療組(n=24)3組,采用改良的Allen's法制作脊髓損傷模型。從脊髓損傷大鼠模型建立后第一天開始,脊髓損傷治療組大鼠按24mg/kg給予2ME2腹腔注射,連續(xù)注射7天。脊髓損傷組大鼠給予等劑量生理鹽水腹腔注射,假手術組不給予干預措施。在第7d將提取大鼠脊髓標本,應用免疫熒光檢測p-Tau(Ser 262)蛋白,應用Western blot技術檢測p-Tau(Ser 262)蛋白表達水平。結果： 免疫熒光檢測p-Tau(Ser 262)陽性細胞數(shù)量(個/高倍視野,x400)顯示：脊髓損傷組(19.05±1.34)和脊髓損傷2ME2治療組(10.36±1.28)脊髓損傷后p-Tau(Ser 262)蛋白表達與假手術組(5.21±1.03)相比增加,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。說明脊髓損傷后,脊髓組織中的Tau蛋白表達增加。脊髓損傷治療組p-Tau(Ser 262)蛋白表達與脊髓損傷組相比明顯減少,差異具有顯著意義(p0.05)。2ME2對脊髓的作用可能通過降低Tau蛋白磷酸化水平來實現(xiàn)。為了進一步驗證實驗的可靠性,我們應用Western blot檢測p-Tau(Ser262)蛋白光密度。Western blot結果顯示,脊髓損傷組(0.607±0.105)和脊髓損傷治療組(0.283±0.094)p-Tau(Ser 262)蛋白表達較假手術組(0.099±0.016)增加,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05),脊髓損傷治療組p-Tau(Ser 262)蛋白表達與脊髓損傷組相比明顯減少,差異具有顯著意義(p0.05)。結論：脊髓損傷后脊髓組織Tau蛋白表達增加；經(jīng)2ME2治療后脊髓組織磷酸化的Tau蛋白水平降低。第三章 2ME2對急性腦梗死大鼠神經(jīng)功能的影響目的：探討2ME2對急性腦梗死大鼠腦組織神經(jīng)功能及細胞凋亡的影響。方法：72只大鼠隨機分為假手術組、腦梗死組和2ME2治療組3組。每組大鼠24只。在采用線栓法制作大鼠大腦中動脈腦梗死模型24h后治療組按24mg/kg給予2ME2腹腔注射,連續(xù)注射7天。腦梗死組大鼠給予等劑量生理鹽水腹腔注射,假手術組不給予干預措施。第7天對大鼠進行神經(jīng)功能分析。第7天處死大鼠,免疫熒光檢測大鼠腦組織中凋亡相關基因Caspase-3的表達情況,通過TUNEL凋亡原位檢測試劑盒檢測神經(jīng)細胞凋亡。通過TTC染色觀察腦組織梗死范圍變化。結果：Bederson標準評分結果顯示：與假手術組(0.333+0.492)比較,腦梗塞組(2.000±0.8543)和2ME2治療組(1.250±0.866)大鼠神經(jīng)功能評分顯著升高(P0.05)。而在2ME2治療的大鼠中,其評分較模型組明顯下降(P0.05)。不同處理組大鼠腦組織中Caspase-3水平比較結果顯示：與假手術組(0.252±0.079)比較,模型組(1.065±0.134)和治療組(0.691±0.136)大鼠腦組織中Caspase-3的表達水平顯著升高(P0.05)。而在2ME2治療的大鼠中,其腦組織中Caspase-3表達水平較模型組明顯下降(P0.05)。大鼠建模后7天腦組織細胞凋亡數(shù)量較多,而經(jīng)過2ME2治療的大鼠腦組織中細胞凋亡數(shù)量較少,對凋亡水平和進行定量分析顯示,與假手術組(42.750±8.572)比較,模型組(161.917±10.850)大鼠腦組織中凋亡細胞數(shù)顯著性增加(P0.05)。而治療組(82.417±8.702)大鼠腦組織中凋亡細胞數(shù)較模型組則顯著性下降(P0.05),但是其水平仍然顯著高于假手術組(P0.05)結論：2ME2可以改善急性腦梗死大鼠的神經(jīng)功能,降低大鼠腦組織神經(jīng)細胞凋亡水平,對神經(jīng)具有一定保護作用,為臨床急性腦梗死治療提供了一定的參考依據(jù)。
【關鍵詞】：2-甲氧基雌二醇 脊髓損傷 凋亡 Tau蛋白 腦梗死
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R651.2;R743.3
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 研究背景18-30
• 參考文獻22-30
• 第一章 2ME2有效改善脊髓損傷大鼠運動功能并減少細胞凋亡30-57
• 一、前言30-31
• 二、材料和方法31-38
• 三、結果38-42
• 四、討論42-47
• 五、結論47
• 參考文獻47-57
• 第二章 大鼠脊髓損傷(SCI)后TAU蛋白磷酸化的變化及2ME2對TAU蛋白磷酸化的影響57-81
• 一、前言57-58
• 二、材料和方法58-67
• 三、結果67-70
• 四、討論70-72
• 五、結論72
• 參考文獻72-81
• 第三章 2ME2對急性腦梗死大鼠神經(jīng)功能及細胞凋亡的影響81-100
• 一、前言81-82
• 二、材料和方法82-91
• 三、結果91-94
• 四、討論94-96
• 五、結論96-97
• 參考文獻97-100
• 全文總結100-102
• 綜述102-116
• 參考文獻108-116
• 在學所發(fā)表論文116-117
• 致謝117-119
• 統(tǒng)計學證明119

  本文關鍵詞：2-甲氧基雌二醇對脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能、TAU蛋白影響及對急性腦梗死大鼠神經(jīng)功能影響的實驗研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：498164