HPV-16感染對非小細胞肺癌和A549細胞的影響及miRNAs表達改變的研究

發(fā)布時間：2017-06-20 12:06

本文關(guān)鍵詞：HPV-16感染對非小細胞肺癌和A549細胞的影響及miRNAs表達改變的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[背景與目的]人乳頭狀瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)是一種嗜上皮性病毒,有高度的特異性,有些型別HPV與惡性腫瘤發(fā)生的密切相關(guān),稱為高危型HPV。1995年世界衛(wèi)生組織(WHO)、國際癌癥研究學會(IARC)就將HPV16和18型歸為致癌性的一類型中,同時宣布HPV感染是引起宮頸癌最主要的病因。近20年來的研究表明,高危型HPV感染除了與宮頸癌關(guān)系密切外,還可能與肺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤之一,吸煙、大氣污染等是肺癌發(fā)生的重要危險因素已得到大家的普遍認可,但其確切病因仍尚不十分明確。近20年來HPV感染與肺癌的病因?qū)W關(guān)系已逐漸引起研究者們的注意。云南省尤其是宣威、個舊地區(qū)肺癌的發(fā)生率和死亡率高居全國首位,近30年來,相關(guān)部門針對相關(guān)的防護措施采取了積極行動,但肺癌的發(fā)病率和死亡率仍居高不下,成為嚴重威脅我省人民生命健康的主要因素之一。HPV感染在云南地區(qū)肺癌的感染情況如何?二者是否具有相關(guān)性?闡明二者的關(guān)系將對云南地區(qū)肺癌的防治具有十分重大的意義。本課題我們擬對收集的云南地區(qū)的94例肺癌,48例肺良性病變的新鮮冰凍組織標本進行HPV DNA檢測并分型,了解云南地區(qū)肺癌HPV感染情況及常見HPV型別。E6和E7是HPV基因組早期區(qū)基因編碼的主要的致癌蛋白。將HPV-16E6-E7基因整合入A549細胞中的關(guān)鍵在于載體的選擇。慢病毒載體(Lentivirus vector)具有感染譜廣泛,能有效感染各期細胞,轉(zhuǎn)移基因片段容量大,長期穩(wěn)定表達外源基因等顯著優(yōu)點,且不產(chǎn)生任何有效的細胞免疫應答,是將基因整合入細胞的良好運載工具。本研究設計通過將重組HPV-16E6-E7基因的慢病毒感染人肺腺癌A549細胞,分析觀察HPV-16E6-E7基因轉(zhuǎn)染對肺腺癌A549細胞生物學行為所發(fā)生的變化。miRNA (microRNA)在生物體生長發(fā)育、細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等細胞生物學過程中起著非常關(guān)鍵的作用。許多腫瘤中有的miRNAs表達上調(diào),有的miRNAs表達下調(diào),可能發(fā)揮著癌基因或抑癌基因的作用。目前對HPV相關(guān)非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC) 的 miRNAs表達改變的研究較少。本研究采用miRNA表達譜芯片技術(shù)結(jié)合實時熒光定量PCR檢測檢測人肺腺癌A549細胞轉(zhuǎn)染HPV-16 E6-E7前后miRNAs表達水平的變化,以期探索HPV-16感染對肺癌niRNAs表達的影響,為高危HPV致癌機制提供實驗依據(jù)。[方法]1、收集94例非小細胞肺癌(NSCLC)和48例肺良性病變組織,應用基因組DNA小量試劑盒提取組織標本基因組DNA；通過基因測序法對HPV-DNA陽性標本的型別進行檢測。2、結(jié)合病人的臨床資料,對HPV感染與肺癌的相關(guān)性進行分析。3、采用基因重組技術(shù)獲得HPV-16 E6-E7基因的慢病毒,通過基因測序等方法鑒定其準確性。4、重組HPV-16 E6-E7'漫病毒進行包裝后感染人腺癌A549細胞,通過RT-PCR和Western-blot驗證轉(zhuǎn)染得到A549細胞能表達目的基因E6-E7及E6、E7蛋白。5、用CCK-8試劑盒、流式細胞儀、酶聯(lián)免疫吸附法、Transwell、室等檢測重組HPV-16 E6-E7慢病毒感染A549細胞的增殖能力、細胞周期、細胞凋亡、體外侵襲能力等方面的變化。6、應用基因芯片和qPT-PCR的方法對人肺腺癌A549細胞轉(zhuǎn)染HPV-16 E6-E7前后miRNAs表達譜進行分析。[結(jié)果]1、94例非小細胞肺癌標本HPV陽性者28例,總陽性率為29.8%(28/94)；48例肺良性病變組織HPV陽性者5例,陽性率7.8%(5/48)。經(jīng)測序分型均為單純HPV-16型感染。2、HPV陽性與HPV陰性肺癌組進行比較分析,二者在年齡、性別、吸煙史、病理類型、分化程度及TNM分期之間的差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。3、重組獲得的HPV-16 E6-E7基因的慢病毒載體經(jīng)基因測序表明連接正確。4、經(jīng)重組IPV-16E6-E7慢病毒感染、RT-PCR和Western-blot驗證,獲得了穩(wěn)定表達E6-E7基因的A549細胞。5、HPV-16 E6-E7基因轉(zhuǎn)染人肺腺癌A549細胞后,G0/G1期細胞比例減少,S期和G2/M期細胞比例增加,凋亡減少,細胞增殖活躍,侵襲力增強。6、基因芯片檢測結(jié)果顯示：在轉(zhuǎn)染HPV-16 E6-E7基因的肺腺癌A549細胞中,9個miRNA是下調(diào)的,12個miRNA是上調(diào)的,其中hsa-miR-7d-5p的上調(diào)最顯著。[結(jié)論J1、HPV感染與云南地區(qū)NSCLC的發(fā)生相關(guān),云南地區(qū)肺癌感染的HPV型別主要是HPV-16型。2、HPV-16感染與非小細胞肺癌患者的年齡、性別、吸煙、病理類型、分化程度及TNM分期均無關(guān)。3、HPV-16 E6-E7基因轉(zhuǎn)染人肺腺癌A549細胞后,凋亡減少,細胞增殖力和侵襲力增強。4、HPV-16 E6-E7基因轉(zhuǎn)染肺腺癌A549細胞后,hsa-miR-7d-5p的上調(diào)最顯著。hsa-let-7d-5p可能是與HPV致癌過程關(guān)系最為密切的miRNA;
【關(guān)鍵詞】：HPV 非小細胞肺癌 A549細胞 microRNA
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2
【目錄】：