本文關鍵詞：下調(diào)TLR4預防再狹窄的作用及其與吡格列酮抑制效應的比較，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:近些年來,經(jīng)皮穿刺腔內(nèi)冠狀動脈成形術(percutaneous transluminal coronary angioplasty,PTCA)和經(jīng)皮冠狀動脈介入術(percutaneous coronary intervention,PCI)已逐漸成為冠心病及急性冠脈綜合征血運重建的重要治療手段。然而,術后再狹窄(restenosis,RS)卻制約著這項技術的應用與發(fā)展。盡管藥物洗脫支架的問世在一定程度上降低了再狹窄的發(fā)生率,但是越來越多的研究發(fā)現(xiàn)藥物洗脫支架也并非十全十美,仍面臨如遠期炎癥狀態(tài)、支架內(nèi)血栓形成以及RS等等問題�；诖�,我們擬探究是否存在更好的再狹窄預防手段,以期與現(xiàn)有的保護措施結合起來,進一步降低這種并發(fā)癥的發(fā)生率。Toll樣受體4(toll like receptor 4,TLR4)是哺乳動物TLR家族里第一個被發(fā)現(xiàn)的膜受體,其活化后可以激活核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB),繼而誘發(fā)一系列的局部炎癥反應,最終表現(xiàn)為損傷部位內(nèi)膜增生,因此推測其在血管損傷后再狹窄過程中可能發(fā)揮重要作用。但是抑制TLR4表達后是否會減少再狹窄的發(fā)生尚不明確。本研究通過RNA干擾技術下調(diào)TLR4基因,以病毒顆粒包裝將質粒載入動物RS模型以及被脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激增殖下的人主動脈血管平滑肌細胞(Human aortic vascular smooth muscle cells,Ha VSMC)中,測定TLR4相關的炎癥、增殖分子,觀察下調(diào)TLR4對內(nèi)膜新生的抑制程度,以及離體水平細胞增殖、遷移能力產(chǎn)生的影響,探討抑制TLR4基因表達在預防RS中的作用機制。此外,我們比較了RNA干擾與不同濃度吡格列酮對細胞增殖遷移能力的抑制效力。方法:1.在體實驗:根據(jù)本實驗室前期工作基礎,建立兔頸總動脈球囊損傷后再狹窄模型:選取健康新西蘭大白兔50只,隨機分成五組,即正常組(normal control,NC),假手術組(shame,S),模型組(model,M),陰性質粒轉染組(negative,N),以及陽性質粒轉染組(positive,P),每組10只。NC組不予任何干預;S組行頸總動脈分離后動脈夾夾閉右側頸總動脈30分鐘;M組行右頸總動脈球囊拉傷術;N組在進行右側頸動脈球囊拉傷后隨即封閉拉傷段血管,排空積血,管腔內(nèi)注射空載的腺病毒顆粒(滴度1*109 plaque forming unit,pfu)30ul,溫暖潮濕環(huán)境孵育30min;P組在進行右側頸動脈球囊拉傷后管腔內(nèi)注射載有sh RNA-TLR4質粒的腺病毒顆粒(滴度1*109 pfu)30ul,余操作同N組。術后正常兔料喂養(yǎng)14天后處死,進行以下步驟:(1)處死前取血,用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血漿中TNF-α、IL-6水平;(2)留取右頸動脈標本,進行HE染色,測量內(nèi)膜和中膜厚度并計算內(nèi)膜和中膜面積;應用免疫組化法觀察組織TLR4表達。(3)留取右頸動脈標本,采用Real-Time PCR測定TLR4、TNF-α、IL-6和VCAM-1m RNA表達;(4)Western blotting檢測TLR4,炎癥因子NF-κB、VCAM-1、MCP-1以及增殖因子t-AKT、p-AKT、t-m TOR、p-m TOR蛋白的表達。2.離體實驗:選取Ha VSMC細胞系,分別予1μg/ml LPS刺激0h、6h、12h、24h以及48h,確定TLR4表達的峰值時間點。設計、構建2對針對TLR4特異性的sh RNA表達質粒,進行慢病毒包裝,使用帶有綠色熒光蛋白的慢病毒載體介導的sh RNA-TLR4-1,sh RNA-TLR4-2和陰性對照質粒轉染人血管平滑肌細胞系,在熒光倒置顯微鏡下檢測以確認轉染效果,并選擇TLR4抑制效率更高的一組作為sh RNA陽性轉染組(positive,P),另外保留陰性轉染組(negtive,N),不加LPS刺激組(NL)以及單加LPS刺激組(L),再設三組分別給予10μmol/L(Pio10),50μmol/L(Pio50),以及100μmol/L(Pio100)吡格列酮進行預處理,除NL外各組分別予1μg/ml LPS刺激使TLR4表達達到峰值,收細胞,RT-PCR測定TLR4 m RNA表達;Western blotting檢測TLR4、NF-κB、VCAM-1、MCP-1,再測接受LPS刺激1h后上述各組t-AKT、p-AKT的蛋白表達;MTT比色法分別測定細胞增殖生長狀況;劃痕實驗測定細胞24h及48h劃痕修復率;流式細胞術檢測細胞周期分布情況。結果:1.在體部分實驗結果:(1)有創(chuàng)操作成功且存活占83.3%(40/48);(2)ELISA結果顯示:與NC組相比,S、M、N和P組血漿IL-6、TNF-α表達水平顯著升高(p0.05);與M及N組比較,P組血漿IL-6、TNF-α表達無統(tǒng)計學差異(p0.05);(3)HE染色結果顯示,與NC組和S組相比,M、N和P組內(nèi)膜和中膜均增厚,內(nèi)中膜厚度比及內(nèi)中膜面積比均明顯增大(p0.05);與M和N組相比,P組內(nèi)中膜厚度、內(nèi)中膜厚度比及內(nèi)中膜面積比均明顯減少(p0.05)。免疫組化結果表明:NC組及S組血管三層結構中均未見到TLR4陽性表達細胞;M、N及P組均有TLR4陽性表達細胞,主要分布在新生內(nèi)膜層;(4)q RT PCR結果顯示:與NC組和S組相比,M、N和P組TLR4、IL-6、TNF-α和VCAM-1 m RNA表達量升高(P0.05),與M組及N組相比,P組上述因子表達量降低(P0.05);(5)Western-blot結果顯示:與NC組和S組相比,M、N和P組TLR4、NF-κB、MCP-1、VCAM-1、p-AKT和p-m TOR蛋白表達量升高(P0.05);與M和N組相比,P組TLR4、NF-κB、MCP-1和VCAM-1蛋白表達量下降(P0.05),p-AKT和p-m TOR蛋白表達量無明顯變化(p0.05)。2.離體部分實驗結果:(1)1μg/m L LPS刺激Ha VSMC可激活TLR4,并呈現(xiàn)時間依賴性,24h達到其表達峰值;(2)兩條sh RNA-TLR4質粒轉染進入細胞對TLR4抑制效率可達61%及55%;(3)q RT-PCR示P組及吡格列酮預處理各組均可下調(diào)TLR4 m RNA表達量;(4)WB示各組TLR4、NF-κB、MCP-1及VCAM-1表達及關系與q RT-PCR結果類似,LPS刺激后1h即可上調(diào)p-AKT表達量,而sh RNA-TLR4質粒及吡格列酮均可明顯抑制其表達;(5)LPS可以提高細胞增殖能力,sh RNA-TLR4質粒及吡格列酮能夠抑制增殖;(6)流式細胞術分析發(fā)現(xiàn),LPS可以提高細胞在G2及S期的分布,sh RNA-TLR4質粒及吡格列酮可減弱此效應;(7)LPS促進細胞遷移,sh RNA-TLR4質粒及吡格列酮可抑制遷移;(8)以上吡格列酮對于細胞增殖、遷移能力的抑制以及對細胞周期分布的影響呈濃度依賴性,對上述各炎癥因子表達的下調(diào)作用也存在濃度依賴性。(9)sh RNA-TLR4穩(wěn)轉Ha VSMC細胞系對細胞增殖及遷移能力的抑制程度介于50μM-100μM吡格列酮之間。結論:下調(diào)TLR4可以抑制家兔頸動脈球囊損傷后再狹窄的發(fā)生,可能與其抑制局部組織TLR4及其介導的NF-κB、TNF-α、IL-6、MCP-1、VCAM-1等炎癥因子的表達有關。下調(diào)TLR4可以抑制由LPS激活的Ha VSMC增殖遷移,其作用類同于50μM-100μM吡格列酮所達到的效果,提示TLR4可以作為基因水平預防支架內(nèi)再狹窄的新靶點。
【關鍵詞】：TLR4 再狹窄 RNA干擾 血管平滑肌細胞 炎癥 增殖 遷移
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R541.4
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 縮略語/符號說明13-15
• 前言15-17
• 研究現(xiàn)狀、成果15
• 研究目的，方法15-17
• 一、RNA干擾下調(diào)TLR4基因在預防頸動脈球囊損傷所致血管狹窄中的作用17-53
• 1.1 對象和方法17-33
• 1.1.1 對象17-24
• 1.1.2 方法24-33
• 1.2 結果33-43
• 1.2.1 模型建立情況33-34
• 1.2.2 病理分析結果34-39
• 1.2.3 免疫組化情況39
• 1.2.4 提取RNA的定性及各目的基因mRNA的定量39-41
• 1.2.5 各目的基因蛋白表達的定量41-42
• 1.2.6 各組血清中IL-6 及TNF-α 的表達水平42-43
• 1.3 討論43-51
• 1.3.1 再狹窄概況及研究背景43-44
• 1.3.2 TLR4信號通路44-46
• 1.3.3 再狹窄動物模型46-49
• 1.3.4 TLR4信號通路在再狹窄模型病理生理過程中的作用49-51
• 1.4 小結51-53
• 二、shRNA-TLR4質粒穩(wěn)轉人主動脈血管平滑肌細胞系對細胞增殖、遷移能力的抑制效應及其與吡格列酮預處理的比較53-79
• 2.1 對象和方法53-60
• 2.1.1 實驗材料53-54
• 2.1.2 實驗方法54-60
• 2.2 結果60-69
• 2.2.1 正常培養(yǎng)的HaVSMC60
• 2.2.2 最佳刺激時間的確定60-61
• 2.2.3 質粒穩(wěn)定轉染進入細胞系的驗證61
• 2.2.4 抑制效率的確定61-62
• 2.2.5 各組細胞中TLR4 mRNA表達量62
• 2.2.6 各組細胞中目的基因蛋白表達量62-63
• 2.2.7 各組細胞增殖能力63-65
• 2.2.8 各組細胞所處細胞周期分布65-66
• 2.2.9 各組細胞遷移能力66-69
• 2.3 討論69-78
• 2.3.1 血管平滑肌細胞炎癥增殖模型69
• 2.3.2 shRNA-TLR4對細胞增殖、遷移的影響69
• 2.3.3 噻唑二烷酮69-71
• 2.3.4 RNA干擾71-78
• 2.4 小結78-79
• 全文結論79-80
• 論文創(chuàng)新點80
• 局限性80-81
• 參考文獻81-90
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明90-91
• 綜述91-110
• 綜述一.TLR4介導的信號通路與介入治療后再狹窄的形成91-102
• 綜述一參考文獻98-102
• 綜述二.吡格列酮在心血管系統(tǒng)疾病中的應用及研究102-110
• 綜述二參考文獻106-110
• 致謝110

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 羅廷福;李家富;何濤;馮健;龔武田;;阿托伐他汀對血管緊張素Ⅱ誘導的人腸系膜動脈平滑肌細胞增殖和細胞內(nèi)NADPH氧化酶-活性氧通路的影響[J];中國心血管雜志;2010年03期

  本文關鍵詞：下調(diào)TLR4預防再狹窄的作用及其與吡格列酮抑制效應的比較，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：437660