本文關(guān)鍵詞：Genistein及其改構(gòu)體KBU2046抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的作用和分子機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：【目的】已有研究提示染料木黃酮Genistein可有效抑制前列腺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,但隨著劑量增加會(huì)產(chǎn)生毒性和雌激素樣副作用。為保留其抗腫瘤活性而削減其毒副作用,前期已在Genistein基礎(chǔ)上進(jìn)行改構(gòu)得到小分子化合物KBU2046。本研究旨在探討Genistein及KBU2046對(duì)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的作用及相關(guān)分子機(jī)制�！痉椒ā勘菊n題應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)方法具體包括,采用CCK8試劑盒檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響;通過(guò)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞克隆形成能力的影響;通過(guò)劃痕、transwell侵襲/遷移、高內(nèi)涵運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)觀察藥物對(duì)細(xì)胞侵襲、運(yùn)動(dòng)能力的影響;建立結(jié)腸癌原位種植模型,結(jié)合小動(dòng)物活體成像技術(shù)評(píng)估藥物對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用;通過(guò)免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)染色檢測(cè)原位腫瘤細(xì)胞中增殖標(biāo)志物Ki67和血管內(nèi)皮標(biāo)志物CD34的表達(dá)以評(píng)估腫瘤細(xì)胞增殖能力和瘤內(nèi)血管形成能力;采用q PCR array篩選藥物影響的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因并通過(guò)western blot、q PCR以及IHC染色分別在細(xì)胞及動(dòng)物原位瘤組織中進(jìn)行驗(yàn)證;在結(jié)腸癌患者腫瘤組織中通過(guò)IHC分析所得分子和臨床指標(biāo)的相關(guān)性;采用Western blot研究藥物對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶磷酸化水平的影響�！窘Y(jié)果】目前已取得的主要結(jié)果小結(jié)如下:在結(jié)腸癌細(xì)胞系和正常腸粘膜上皮細(xì)胞中,10μM以上Genistein可抑制細(xì)胞增殖活性和克隆形成能力;10μM Genistein可在不產(chǎn)生細(xì)胞毒性的前提下抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移、侵襲和運(yùn)動(dòng)能力;KBU2046在劑量高達(dá)50μM時(shí)仍不對(duì)結(jié)腸正常細(xì)胞或癌細(xì)胞產(chǎn)生明顯毒性;10μM KBU2046可以有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移、侵襲和運(yùn)動(dòng)能力;在裸鼠原位結(jié)腸癌種植模型中,Genistein和KBU2046可有效抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的肝/肺轉(zhuǎn)移,而對(duì)腫瘤生長(zhǎng)并無(wú)明顯抑制。為探討兩種藥物抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,采用q PCR array對(duì)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因進(jìn)行了篩選,經(jīng)體內(nèi)、外驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)Genistein和KBU2046均可抑制FLT4和MMP2的表達(dá)。進(jìn)一步研究還提示結(jié)腸癌患者腫瘤組織中FLT4表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),其中高表達(dá)FLT4提示預(yù)后較差。通過(guò)檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞中經(jīng)藥物處理后蛋白激酶磷酸化水平的變化,發(fā)現(xiàn)在相同濃度條件下,Genistein可抑制Akt、Erk1/2、p38 MAPK磷酸化,而KBU2046僅抑制Erk1/2、p38 MAPK磷酸化,且效果較Genistein更強(qiáng),二者對(duì)JNK磷酸化均無(wú)明顯抑制作用。具體結(jié)果如下:在正常腸上皮細(xì)胞HIEC、結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、HT29、SW620中檢測(cè)不同劑量Genistein對(duì)細(xì)胞活性的影響,發(fā)現(xiàn)Genistein在10μM以上會(huì)對(duì)結(jié)腸細(xì)胞產(chǎn)生殺傷活性。為專注于藥物對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的影響,本研究選取10μM進(jìn)行以下相關(guān)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和高內(nèi)涵運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)10μM Genistein能有效抑制細(xì)胞的侵襲、遷移和運(yùn)動(dòng)能力。在明確Genistein可以在體外抑制結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲、遷移和運(yùn)動(dòng)的前提下,采用相同的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)其改構(gòu)體KBU2046對(duì)細(xì)胞活性和侵襲、遷移能力的影響,發(fā)現(xiàn)在與Genistein相同的濃度下,KBU2046的細(xì)胞毒性遠(yuǎn)低于Genistein,但亦能有效抑制細(xì)胞的侵襲和遷移能力。為進(jìn)一步觀察Genistein和KBU2046對(duì)結(jié)腸癌體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響,我們首先通過(guò)移植皮下瘤到裸鼠結(jié)腸的方法建立了結(jié)腸癌原位種植轉(zhuǎn)移模型,并通過(guò)小動(dòng)物成像系統(tǒng)對(duì)穩(wěn)定表達(dá)luciferase的HCT116細(xì)胞進(jìn)行定量評(píng)估原位腫瘤的大小和肝肺轉(zhuǎn)移的程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Genistein和KBU2046在不影響原位腫瘤生長(zhǎng)的條件下,均能在不同程度上抑制腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。對(duì)原位腫瘤組織中細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki67和血管內(nèi)皮標(biāo)志物CD34的表達(dá)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)藥物并沒(méi)有顯著影響細(xì)胞增殖,但可以抑制腫瘤內(nèi)部新生血管形成,并表現(xiàn)出劑量依賴的趨勢(shì)。對(duì)原位腫瘤大小與肝/肺轉(zhuǎn)移程度進(jìn)行相關(guān)分析沒(méi)有發(fā)現(xiàn)二者之間存在顯著相關(guān)性。為探討藥物的作用機(jī)制,我們通過(guò)PCR array對(duì)兩種藥物處理后細(xì)胞中轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的變化進(jìn)行了檢測(cè),并通過(guò)q PCR、western blot進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Genistein和KBU2046均可在不同程度上抑制細(xì)胞中MMP2和FLT4的表達(dá)水平。進(jìn)一步通過(guò)IHC染色發(fā)現(xiàn)在原位腫瘤組織中,Genistein和KBU2046處理后也能引起MMP2和FLT4表達(dá)下調(diào)。MMPs家族蛋白在腫瘤轉(zhuǎn)移尤其腫瘤侵襲中的研究較為詳盡,在多種腫瘤中都有MMP2與轉(zhuǎn)移相關(guān)的報(bào)道。而FLT4與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的直接關(guān)系尚不明確。目前在多種腫瘤類型中有關(guān)其表達(dá)與臨床病理資料相關(guān)性的結(jié)果不盡相同。為進(jìn)一步驗(yàn)證FLT4在結(jié)腸癌患者中與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性,我們通過(guò)組織芯片在60例結(jié)腸癌患者的腫瘤組織及來(lái)自同一患者的正常組織中檢測(cè)了FLT4表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)FLT4在腫瘤組織中表達(dá)顯著高于正常組織,且其表達(dá)水平與惡性程度相關(guān)。通過(guò)Kaplan-Meier方法進(jìn)行生存分析發(fā)現(xiàn)FLT4表達(dá)水平與患者生存成負(fù)相關(guān)。Genistein作為一種酪氨酸蛋白激酶抑制劑,可以抑制多種蛋白激酶的磷酸化水平。為比較KBU2046和Genistein作用機(jī)制的差異,我們對(duì)蛋白激酶磷酸化的改變進(jìn)行了初步研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Genistein和KBU2046對(duì)蛋白激酶磷酸化的影響不盡相同。具體來(lái)講,KBU2046對(duì)ERK1/2和p38磷酸化的抑制程度較Genistein顯著,但對(duì)Akt磷酸化沒(méi)有明顯抑制作用,二者對(duì)JNK磷酸化均沒(méi)有顯著影響�！窘Y(jié)論】Genistein及其改構(gòu)體KBU2046在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)結(jié)腸癌原位種植模型中均顯示了抑制結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的活性;這一作用可能通過(guò)抑制轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MMP2和FLT4表達(dá)實(shí)現(xiàn)。兩種藥物在對(duì)蛋白激酶活性的抑制上存在差異,提示KBU2046雖然通過(guò)保留Genistein的骨架結(jié)構(gòu)而保留了其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的主要活性,但具體作用機(jī)制可能與母體有所不同,這將在以后的工作中進(jìn)行深入研究。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移 Genistein KBU2046 裸鼠結(jié)腸癌原位種植模型 FLT4
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.35
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表7-8
• 中文摘要8-12
• 英文摘要12-17
• 前言17-19
• 文獻(xiàn)回顧19-37
• 第一部分 結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制及治療現(xiàn)狀19-27
• 第二部分 Genistein的研究現(xiàn)狀27-37
• 第一部分Genistein對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲運(yùn)動(dòng)的影響37-51
• 1 材料37-38
• 1.1 細(xì)胞37
• 1.2 主要生化試劑37-38
• 1.3 主要儀器38
• 2 方法38-40
• 2.1 CCK8細(xì)胞生存率檢測(cè)38
• 2.2 CCK8細(xì)胞增殖檢測(cè)38
• 2.3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)38-39
• 2.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)39
• 2.5 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)39-40
• 2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)40
• 2.7 高內(nèi)涵運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)40
• 3 結(jié)果40-47
• 3.1 Genistein對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞活性的影響40-41
• 3.2 Genistein對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力的影響41-42
• 3.3 Genistein對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞克隆形成能力的影響42-44
• 3.4 Genistein對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力的影響44
• 3.5 Genistein對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和運(yùn)動(dòng)能力的影響44-47
• 4 討論47-51
• 第二部分KBU2046對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲運(yùn)動(dòng)的影響51-61
• 1 材料51-52
• 1.1 細(xì)胞51
• 1.2 主要生化試劑51
• 1.3 主要儀器51-52
• 2 方法52-54
• 2.1 CCK8細(xì)胞生存率檢測(cè)52
• 2.2 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)52
• 2.3 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)52-53
• 2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)53
• 2.5 高內(nèi)涵運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)53-54
• 3 結(jié)果54-58
• 3.1 KBU2046對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞活性的影響54-55
• 3.2 KBU2046對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力的影響55
• 3.3 KBU2046對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和運(yùn)動(dòng)能力的影響55-58
• 4 討論58-61
• 第三部分Genistein和KBU2046對(duì)原位種植結(jié)腸癌體內(nèi)轉(zhuǎn)移的抑制61-87
• 1 材料61-62
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物61
• 1.2 細(xì)胞系61-62
• 1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所需手術(shù)器械及用品62
• 1.4 生化試劑62
• 1.5 儀器設(shè)備62
• 2 方法62-66
• 2.1 慢病毒感染建立HCT116-Luc細(xì)胞系62-63
• 2.2 原位移植瘤模型的建立63-64
• 2.3 Genistein及KBU2046灌胃64
• 2.4 小動(dòng)物活體成像及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移程度評(píng)估64
• 2.5 原位腫瘤大小測(cè)量64-65
• 2.6 HE染色65
• 2.7 免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果分析65-66
• 3 結(jié)果66-81
• 3.1 慢病毒感染建立HCT116-Luc細(xì)胞系66-67
• 3.2 裸鼠原位種植模型的建立67-70
• 3.3 Genistein和KBU2046對(duì)原位腫瘤大小的影響70-73
• 3.4 Genistein和KBU2046對(duì)遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的影響73-77
• 3.5 Genistein和KBU2046對(duì)小鼠的毒性作用77-78
• 3.6 腫瘤大小與遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的相關(guān)性78-79
• 3.7 Genistein和KBU2046對(duì)原位腫瘤中Ki67的表達(dá)水平的影響79-80
• 3.8 Genistein和KBU2046對(duì)原位腫瘤中CD34的表達(dá)水平的影響80-81
• 4 討論81-87
• 第四部分Genistein和KBU2046抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究87-108
• 1 材料87-88
• 1.1 組織芯片和組織切片制備87
• 1.2 生化試劑87-88
• 1.3 主要儀器88
• 2 方法88-94
• 2.1 PCR array88-92
• 2.2 q PCR92-93
• 2.3 Western blot93
• 2.4 免疫組織化學(xué)染色93-94
• 2.5 免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果評(píng)估94
• 3 結(jié)果94-105
• 3.1 PCR array對(duì)Genistein和KBU2046處理后腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的篩選94-98
• 3.2 PCR array篩選結(jié)果的驗(yàn)證98-101
• 3.3 結(jié)腸癌患者中FLT4表達(dá)與臨床病理資料和患者預(yù)后的相關(guān)分析101-104
• 3.4 Genistein和KBU2046對(duì)蛋白激酶磷酸化的影響104-105
• 4 討論105-108
• 小結(jié)108-109
• 參考文獻(xiàn)109-127
• 附錄127-142
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果142-144
• 致謝144-146

  本文關(guān)鍵詞：Genistein及其改構(gòu)體KBU2046抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的作用和分子機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：404603