本文關鍵詞：生物降解復合材料聯(lián)合頜骨骨髓間充質干細胞促進不同類型骨缺損修復的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：牙周病是常見的口腔疾病,主要造成牙齒支持組織的破壞。目前牙周再生技術已被廣泛用于促進牙支持組織的愈合。而再生技術的關鍵之一——植骨材料,通常用來治療骨缺損。現(xiàn)在臨床上主要的植骨材料包括自體骨、異體骨、異種骨和合成材料。自體骨是理想的植骨材料,但缺點是造成二次創(chuàng)傷、獲取有限、易吸收等;異體骨具有良好的骨誘導和骨傳導作用,但有免疫排斥和疾病傳染的風險;異種骨Bio-Oss和合成材料殼聚糖是良好的生物活性支架材料,在人體內具有良好的生物相容性。近年來,殼聚糖由于其生物相容性好、可降解、具有抗炎作用等受到越來越多的關注。它被廣泛用于支架材料、藥物載體、傷口愈合等方面。Bio-Oss植骨材料是一種碳酸鹽磷灰石結晶體,通過將牛骨特殊加工處理,去除其蛋白質和其他有機成分,并保持天然骨的無機結構,從而得到特別的骨引導支架,有助于新骨的形成,促進血管的再生和血凝塊的穩(wěn)定。目前天然高分子復合材料在骨組織工程中發(fā)揮著越來越重要的作用。下一代生物支架應當具備生物活性和生物降解特點,包括模擬自然骨的生理作用和激活體內組織再生過程。復合材料則是基于上述要求,將可降解高分子材料和生物活性支架結合于一身,比如將殼聚糖和Bio-Oss組合。殼聚糖的機械強度低于自然骨,不能承重和支撐外力,并且其自身不具有骨誘導作用,這就需要加入生物活性支架改善機械強度和骨誘導性。目前有很多材料加入殼聚糖中能改善其機械和生物特性,比如羥基磷灰石、β-三磷酸鈣、硫酸鈣、藻酸鹽等。這樣的復合材料具有特定的物理、生物、機械性能和可控制的降解性。骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)是骨組織工程中成熟的種子細胞,具有多向分化潛能。大部分已有研究的BMMSCs來自長骨或髂骨骨髓。由于其獲取方便,體外擴增鑒定簡單,被用來和多種生物材料復合共同促進再生。但目前很多研究表明,頜骨來源的骨髓間充質干細胞(jaw bone-derived BMMSCs,JBMMSCs)相對髂骨來源BMMSCs具有更強的生物學特性。將生物材料與干細胞復合后形成的新型材料是否就能達到理論上的先進性?實用臨床效果如何?目前仍無定論;尤其是人體應用受到諸多條件和倫理所限,無法觀察到是否形成了真正的組織學再生過程。所以本研究將通過體外材料和細胞學實驗、體內結構形態(tài)學和定量組織學實驗來系統(tǒng)觀察和評估殼聚糖/Bio-Oss復合材料與人頜骨骨髓間充質干細胞(Human jaw bone marrow mesenchymal stem cells,h JBMMSCs)促進組織愈合的可行性以及前景。目的1、制備不同比例的殼聚糖/Bio-Oss復合材料并比較其理化性能;體外比較復合材料對hJBMMSCs粘附、增殖等生理特性的影響;2、觀察殼聚糖/Bio-Oss復合材料聯(lián)合h JBMMSCs在大鼠顱骨缺損中的骨再生潛能;3、比較篩選一種合適的牙周骨缺損組織修復模型;4、將殼聚糖/Bio-Oss復合材料聯(lián)合hJBMMSCs植入所篩選的牙周骨缺損中評價其促牙周再生能力;5、為開發(fā)新型復合材料促進牙周和口腔組織再生提供理論和實驗依據(jù)。方法1、殼聚糖/Bio-Oss復合材料理化性能檢測按照殼聚糖和Bio-Oss粉的比例(100:0、75:25、50:50、25:75)將Bio-Oss粉加入殼聚糖/β-GP溶液中,凍干后用掃描電鏡觀察材料的孔徑及孔隙率,測定材料的抗壓強度、溶脹率、降解率。2、殼聚糖/Bio-Oss復合材料與hJBMMSCs體外共培養(yǎng)的生物學特性評價采用組織塊法分離培養(yǎng)原代h JBMMSCs,有限稀釋法純化細胞;流式細胞儀檢測細胞表面標記物;細胞克隆形成能力;成脂、成骨誘導檢測細胞多向分化能力;CCK-8法檢測細胞在材料上的增殖;掃描電鏡觀察細胞在材料表面的粘附;試劑盒檢測材料對細胞堿性磷酸酶活性的影響。3、殼聚糖/Bio-Oss復合材料聯(lián)合h JBMMSCs修復大鼠顱骨缺損的實驗研究將hJBMMSCs與殼聚糖/Bio-Oss復合材料共培養(yǎng),植入8mm直徑的SD大鼠極限顱骨缺損,8周后觀察大體情況、Micro-CT檢測缺損修復情況、HE染色和Masson's trichrome染色觀察缺損愈合情況,免疫組化觀察細胞植入后成骨細胞分化相關蛋白(骨鈣素)表達情況。4、不同牙周骨缺損類型對引導組織再生術的組織修復能力的影響分別制備不同大小的1-,2-,3-壁牙周骨缺損和水平型III°根分叉骨缺損,植入Bio-Oss骨粉和Bio-Gide膜,8周后觀察大體牙周愈合情況、Micro-CT檢測骨缺損修復情況、HE染色和Masson trichrome觀察牙周組織修復情況。篩選出適合評估牙周組織再生的骨缺損模型。5、殼聚糖/Bio-Oss復合材料聯(lián)合h JBMMSCs修復犬1壁牙周骨缺損的實驗研究將h JBMMCs與殼聚糖/Bio-Oss復合材料共培養(yǎng),植入1壁牙周骨缺損,8周后觀察大體情況、Micro-CT檢測骨缺損修復情況、HE染色和Masson trichrome觀察骨缺損愈合情況、免疫組化觀察細胞植入后成骨細胞分化相關蛋白(骨鈣素)表達情況。結果1、單純殼聚糖組(C組)的孔徑、孔隙率、溶脹率和降解率均高于三組殼聚糖/Bio-Oss復合材料[C/B(75:25)、C/B(50:50)、C/B(25:75)],而C/B(75:25)組和C/B(50:50)組的孔隙率、溶脹率和降解率均高于C/B(25:75)組;同時C/B(75:25)組的降解率高于C/B(50:50)組;在抗壓強度方面,三組殼聚糖/Bio-Oss抗壓強度均高于C組,其中C/B(25:75)、C/B(50:50)組高于C/B(75:25)組。2、h JBMMSCs體外原代培養(yǎng)后,細胞貼壁培養(yǎng),呈長梭形,并具有自我增殖和細胞克隆能力。細胞能陽性表達CD90、CD105、CD29、CD146、STRO-1等間充質來源干細胞標志,陰性表達CD34和CD45造血干細胞標志。成骨誘導可見鈣化結節(jié)沉淀,成脂誘導可見脂滴形成。h JBMMSCs在三種材料(殼聚糖、殼聚糖/Bio-Oss、Bio-Oss)表面均能良好的粘附、生長,且三種材料對細胞的ALP活性影響無明顯差異。3、第8周時,大體觀察及Micro-CT示:比較新骨體積分數(shù),實驗組(C/B+cell、C+cell、B、C/B、C)高于對照組(p0.05),B組和C/B+cell組高于C+cell組、C/B組和C組(p0.05);組織學觀察及定量分析示(p0.05):比較新骨面積,實驗組(C/B+cell、C+cell、B、C/B、C)的新骨量高于對照組(p0.05),B組、C/B+cell組、C/B組、C+cell組高于C組(p0.05)。免疫組化顯示,植入細胞組(C/B+cell、C+cell)新生骨周圍及內部可見OCN陽性表達細胞,無細胞組(C、C/B、B、對照組)新生骨周圍表達遠遠少于加細胞組。4、第8周時,大體觀察及Micro-CT示:1-,2-,3-壁骨缺損和III°根分叉缺損實驗組的新骨量均高于各組對應的對照組(p0.05);組織學觀察及定量分析示:比較新骨高度和面積,1-,2-,3-壁骨缺損和III°根分叉骨缺損實驗組均高于對應的對照組(p0.05);而對于結締組織附著、結合上皮長度、新生牙骨質及新生牙周膜指標等,只有1壁骨缺損的實驗組均優(yōu)于各種對應的對照組(p0.05)。5、第8周時,大體觀察及Micro-CT示:比較新生骨量,所有實驗組(C、C+cell、C/B、C/B+cell、Bio-Oss)均高于對照組(p0.05),B組高于C組、C+cell組、C/B組(p0.05);組織學觀察及定量分析示:比較新骨高度和新骨面積,C組、C+cell組、C/B+cell組、B組和C/B組高于對照組(p0.05),B組、C/B組和C/B+cell組高于C組(p0.05);新生牙周膜、新生牙骨質的指標中,C/B+cell組和B組高于C/B組、C+cell組、C組、對照組(p0.05);免疫組化顯示:植入細胞組(C/B+cell、C+cell)新生骨周圍及內部可見OCN陽性表達細胞,無細胞組(C、C/B、B、對照組)新生骨周圍表達遠遠少于加細胞組。結論1、殼聚糖和Bio-Oss復合后能明顯提高殼聚糖的抗壓強度、降低其降解性能。殼聚糖和Bio-Oss質量比為50:50時,其孔徑、抗壓強度、溶脹率、降解率等方面性能較好。2、hJBMMSCs在殼聚糖/Bio-Oss復合材料上能良好的生長和增殖,殼聚糖/Bio-Oss復合材料對h JBMMSCs的ALP活性無明顯影響,具有良好的生物相容性。3、牙周骨缺損模型中,1壁骨缺損與2壁、3壁骨缺損及水平III°根分叉骨缺損相比,雖然病損體積更大,組織修復的來源少,卻在牙周再生的各項指標中具有更大的可比性,更適合作為評估牙周再生動物實驗模型。4、殼聚糖/Bio-Oss復合材料聯(lián)合hJBMMSCs,部分hJBMMSCs分化為成骨細胞,與體內自身細胞共同促進了大鼠顱骨缺損、犬牙周1壁骨缺損的修復,并且與單純殼聚糖和殼聚糖/Bio-Oss相比具有更強的促進成骨及促牙周組織再生能力。雖然在骨量方面沒有超過單純Bio-Oss材料,但從材料存留量以及生物學修復基礎等多方面綜合考量其應有更強的應用前景。
【關鍵詞】：殼聚糖 骨髓間充質干細胞 Bio-Oss 顱骨缺損 牙周骨缺損
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R783.1
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-12
• 英文摘要12-18
• 前言18-20
• 文獻回顧20-40
• 實驗一 殼聚糖/Bio-Oss復合材料的制備和理化性質的測定40-48
• 1 材料40-41
• 2 方法41-43
• 3 結果43-45
• 4 討論45-48
• 實驗二 殼聚糖/Bio-Oss復合材料與h JBMMSCs體外共培養(yǎng)的生物學特性評價48-56
• 1 材料48-49
• 2 方法49-51
• 3 結果51-54
• 4 討論54-56
• 實驗三 殼聚糖/Bio-Oss復合材料聯(lián)合h JBMMSCs修復大鼠顱骨缺損的實驗研究56-66
• 1 實驗動物和試劑設備56
• 2 方法56-58
• 3 結果58-62
• 4 討論62-66
• 實驗四 不同牙周骨缺損類型對牙周再生能力的影響66-77
• 1 實驗動物和試劑設備66
• 2 實驗方法66-69
• 3 結果69-75
• 4 討論75-77
• 實驗五 殼聚糖/Bio-Oss復合材料聯(lián)合h JBMMSCs修復犬1 壁牙周骨缺損的實驗研究77-91
• 1 實驗動物和試劑設備77
• 2 方法77-80
• 3 結果80-86
• 4 討論86-91
• 小結91-92
• 參考文獻92-109
• 個人簡歷和研究成果109-110
• 致謝110

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 Jan Henkel;Maria A.Woodruff;Devakara R.Epari;Roland Steck;Vaida Glatt;Ian C.Dickinson;Peter F.M.Choong;Michael A.Schuetz;Dietmar W.Hutmacher;;Bone Regeneration Based on Tissue Engineering Conceptions  A 21st Century Perspective[J];Bone Research;2013年03期

2 梁多平;智慧;孫智慧;張彪;胡更生;劉曉華;旺盛超;;鈦酸酯偶聯(lián)劑對聚乳酸/3-羥基丁酸同4-羥基丁酸共聚酯/納米羥基磷灰石共混體系流變行為的影響[J];高分子材料科學與工程;2013年12期

3 梁多平;智慧;孫智慧;張彪;何宏;劉曉華;旺盛超;;改性納米HA對PLA-PBAT共混體系結晶與流變性能的影響[J];復合材料學報;2014年03期

4 劉效志;孫淑建;王金華;張健;洪敬軼;何仿;;鎖定鋼板結合人工骨治療老年脛骨平臺骨折的前瞻性研究[J];中國骨與關節(jié)損傷雜志;2014年08期

5 郭海峰;周志強;葉楓;李國平;張志恒;;高比表面積磁性-熒光介孔磷灰石納米紡錘體的制備(英文)[J];稀有金屬材料與工程;2014年11期

6 戴l，

本文編號：400905