本文關鍵詞：登革病毒包膜蛋白EDⅢ抗體中和活性與增強活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：登革熱(dengue)是全球蔓延最快的蟲媒傳播疾病,通過感染登革病毒(DENV)蚊子的叮咬在人群中傳播,全世界40%以上約25億人面臨罹患登革熱危險。感染4種DENV (DENV-1,DENV-2,DENV-3和DENV-4)血清型的其中一種都會引起廣泛的臨床癥狀,從輕微癥狀或典型登革熱,類似于流感樣癥狀,劇烈頭痛和關節(jié)肌肉痛；到小部分患者出現(xiàn)威脅生命的重癥登革熱,曾稱為登革出血熱(dengue hemorrhagic fever, DHF)或登革休克綜合征(dengue shock Syndrome, DSS)。登革熱的傳播常發(fā)生在全球熱帶和亞熱帶氣候的城市和城郊地區(qū),已成為一個主要國際公共衛(wèi)生的重要問題。近些年來,東南亞和美洲地區(qū)的登革熱疫情日趨嚴重,幾乎每年都會在中國的廣東、廣西、海南和福建出現(xiàn)不同程度的流行,其中,廣東地區(qū)是高發(fā)地區(qū)。截止2014年,四種血清型的DENV均在我國發(fā)生過流行,但是以DENV-1較為常見。2014年6月廣州地區(qū)爆發(fā)近二十年最大規(guī)模的登革熱。世界衛(wèi)生組織于2014年強調,目前登革熱沒有有效的治療手段和疫苗,只能夠通過減少及控制傳播媒介蚊子的傳播、避免遭受叮咬的個人防護措施預防登革熱的傳播和發(fā)展。因此,本研究的意義在于能夠對疫苗候選及其安全性評估有所幫助。DENV基因組是單股RNA鏈(大約1lkb),包含單個開放讀碼框,編碼三個結構蛋白和七個非結構蛋白。三個結構蛋白包括衣殼蛋白(capsid, C)、前膜/膜蛋白(premembrane/membrane, prM/M)和包膜蛋白(envelope, E);七個非結構蛋白(nonstructural protein, NS)包括NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、 NS4B和NS5。多聚蛋白的合成在細胞質粗面內質網(wǎng)上完成。E糖蛋白是成熟病毒顆粒主要外露蛋白,以頭尾相連的90個E蛋白二聚體平鋪于病毒顆粒表面脂質雙分子層中。外功能區(qū)劃分為三個結構域和功能域：EDⅠ, EDⅡ, EDⅢ。E蛋白與病毒附著,融合,細胞趨向以及保護性免疫應答的誘導產生有關聯(lián)。黃病毒屬病毒代表致病性基因標志大部分位于E蛋白基因。其中,EDⅢ包含免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)樣域,形成7股Ig樣折疊,介導病毒與附著宿主細胞膜結構之間的相互作用,是中和抗體識別的關鍵表位。DENVE蛋白氨基酸序列同源性高,且是保守的。每種血清型的E蛋白氨基酸序列最小相似性為90%～96%,血清型間E蛋白氨基酸序列相似性一般為60～70%。針對DENV EDⅢ蛋白以及其相應抗體功能研究一直是登革熱研究熱點,大量關于EDⅢ及其抗體的動物性實驗研究表明針對四種血清型強烈的中和保護性的EDⅢ抗體,其識別表位主要位于EDⅢ的側脊和A鏈區(qū)。然而,近些年有研究表明,存在于DENV感染人血清中EDⅢ抗體的中和保護性和增強感染的作用是微弱的,亦有研究表明DENV感染人血清和鼠EDⅢ抗體所識別的表位是相似的。非結構蛋白NS1以多聚體的形式分布于細胞不同區(qū)域,可以分為膜型和分泌型兩種形式,分泌到細胞外的NS1以六聚體形式存在。NS1蛋白參與感染細胞轉運和病毒復制。NS1蛋白能夠作為一個重要的早期診斷的生物標志物,研究表明DENV感染患者在感染早期階段的高濃度。NS1蛋白與后繼嚴重疾病的發(fā)生相關聯(lián),檢測的NS1蛋白量越高其相應疾病越嚴重。使用DENV NS1抗原捕獲ELISA法檢測DENV感染患者血清顯示,感染DENV早期患者NS1蛋白分泌量可高達50ug/ml。因此本研究將其作為評價感染程度的評估指標。目前疫苗研究的難點在于,感染一種DENV血清型并恢復后,機體誘導產生的高效價中和抗體,只對同型病毒具有終生免疫,但對此后感染的其他三種血清型病毒只有部分和短暫的交叉免疫。隨后感染其它血清型病毒會增加罹患重癥登革熱的危險。重癥表現(xiàn)常見于二次異型DENV感染的患者,盡管少數(shù)初次DENV感染的患者也會出現(xiàn)。當二次DENV感染時,先前存在的非中和或亞中和抗體與病毒表面抗原結合,促進病毒-抗體復合體進入FcyR細胞及細胞內攝取,進而導致大量病毒復制和嚴重病理變化,這種現(xiàn)象稱之為抗體依賴性增強(antibody-dependentenhancement, ADE)。正是由于四種DENV血清型感染導致ADE現(xiàn)象的出現(xiàn),嚴重阻礙了登革疫苗的研發(fā)。理想的DENV疫苗必須對四種DENV血清型均具有保護作用；能夠提供終身保護作用；無明顯的局部和全身性不良反應；對登革熱疫區(qū)的全部人口具有普遍的有效性且成本低廉。因此,本研究旨在有助于評估疫苗的增強感染的研究�；谝陨涎芯勘尘�,我們推測,在自然狀態(tài)下,DENV感染機體后,登革病毒的多種抗原成分均能夠誘導機體產生適應性免疫應答,各種抗原成分在抗原競爭中,形成了優(yōu)勢表位與非優(yōu)勢表位,但是后者在抗原競爭中難以有效地刺激中和保護性。因此,我們探索非優(yōu)勢抗原表位是否能夠作為單一的免疫原,刺激機體產生強烈中和保護性且微弱或無增強感染的抗體。本研究集中在以下三個方面：一、DENV EDⅢ交叉反應單抗識別表位的關鍵殘基的確定本團隊前期工作中分別使用四種DENV血清型重組EDⅢ蛋白免疫小鼠,制備了一組抗DENV-1,-2,-3和-4 EDⅢ的單抗,篩選出對四種血清型DENV有交叉反應性的單抗。對這些單抗進行合成重疊多肽掃描分析中發(fā)現(xiàn),大約2/3的交叉反應性單抗特異性識別高度保守的EDⅢ aa310KEVAETQHGT319序列,并且鑒定了這些單抗與重組EDⅢ蛋白結合能力強但中和活性較為復雜,表現(xiàn)為對四種不同血清型DENV出現(xiàn)強烈、中等或無的中和活性。為了進一步明確該氨基酸序列中抗原抗體結合的關鍵殘基,我們采用酵母表面展示技術將DENV EDⅢ蛋白表達在酵母細胞表面,并使用定點突變技術對aa310-319的十個氨基酸進行逐一突變,隨后將突變質粒轉入酵母細胞,獲得十種EDⅢ單點突變蛋白。使用流式細胞分析EDⅢ交叉反應單抗與十種突變體的結合情況。酵母表面展示技術是研究可溶性蛋白間相互作用的有效工具,其可以簡單快速地用于確定抗原與抗體、受體與配基的結合及相互作用。酵母以其真核細胞翻譯后蛋白加工修飾的特點,使其表達產物更接近于天然構象。體外定點突變則是研究蛋白質結構和功能之間的復雜關系常規(guī)工具,能夠簡便、快速且高效的獲得改造DNA序列或DNA表達的目的蛋白,從微觀水平上闡明正常狀態(tài)與突變狀態(tài)的差異性。酵母展示技術與定點突變技術聯(lián)合運用,簡便高效的實現(xiàn)突變DNA序列在蛋白表現(xiàn)情況。研究結果發(fā)現(xiàn),EDⅢ氨基酸序列中的Q316和H317是交叉反應EDⅢ單克隆抗體抗原抗體結合的關鍵殘基,為進一步優(yōu)化修飾EDⅢ亞單位疫苗的策略奠定基礎。二、建立高通量簡便的方法評價DENV抗體的增強功能DENV誘導機體產生的抗體反應是一把雙刃劍,有保護性免疫,也可能加重病情。所以,DENV抗體的研究必須從保護性能和增強感染性能這兩方面著手。DENVE蛋白是主要的保護性抗原,也是中和抗體主要的靶向成份。當具有中和活性的抗體分子與E蛋白抗原決定簇結合,阻止E蛋白與靶細胞結合或者阻止病毒RNA釋放進入易感細胞的細胞質中,即發(fā)揮保護作用。而當亞中和或非中和抗體Fc段與細胞膜上Fcy受體(FcyR)結合,增加了DENV和細胞黏附的機會,從而促使DENV進入細胞,使得細胞易感�；诟腥綝ENV后NS1蛋白分泌與登革熱疾病的嚴重程度是密切相關,本團隊前期建立了測定抗體和血清中和活性的酶聯(lián)免疫斑點微中和實驗(enzyme-linked immunospot microneutralization test, ELISPOT-MNT)方法,能夠方便、客觀地評價DENV抗體的中和活性。因此,為了更全面評價抗體或血清中和保護性和增強活性,我們建立并評估ADE技術是在前期建立的NS1抗原捕獲ELISA檢測DENVNS1蛋白含量的基礎上,用表達FcyR的K562細胞株和已知公認的具有增強活性的單抗4G2為陽性對照,建立了高通量簡便的檢測登革抗體和血清的ADE檢測方法(ADE assay based quantitative measurement of NS1 antigen capture ELISA, ELISA-ADE)。即使用傳統(tǒng)病毒滴度測定方法平行驗證NS1抗原定量新ELISA-ADE方法檢測4G2增強感染時的NS1蛋白含量是否具有一致性,經過Spearman相關分析表明,兩種方法顯著相關。隨后,使用ELISPOT-MNT和ELISA-ADE方法檢測了4G2和6份DENV-1感染患者恢復期血清的中和活性和增強活性,發(fā)現(xiàn)4G2和患者血清的增強峰值均出現(xiàn)在亞中和濃度,符合公認的中和與增強濃度關系,進一步驗證ELISA-ADE方法學的可靠性。并且分析了前期制備具有強烈中和活性的交叉反應EDⅢ單克隆抗體2D73和3E31的中和活性與增強活性的關系。結果顯示,2D73的ADE增強感染峰值同樣出現(xiàn)在亞中和濃度下,而3E31僅有微弱或無增強感染的效應。提示3E31具有作為免疫治療性抗體的潛能。三、 DENV-1感染患者血清和兔抗EDⅢ血清的EDⅢ反應抗體的功能研究DENV EDⅢ是中和抗體的靶標,是有潛力的登革疫苗的候選者。然而,近些年研究表明DENV感染人血清中的EDⅢ抗體僅占DENV總抗體的一小部分,其中和活性和增強活性作用微弱。但我們分析認為：在DENV自然感染中,多種DENV抗原可誘導產生多克隆多特異性抗體,有些誘導保護性反應的表位未必是優(yōu)勢表位,因而在抗原競爭中處于弱勢而不能產生足量的保護性抗體。針對這種情況可利用純化的亞單位疫苗來避免抗原競爭而誘導有效的保護性反應。國外多數(shù)DENV感染患者血清的EDⅢ抗體的研究集中在DENV-2和-3感染,而中國南方地區(qū)60%的DENV感染為DENV-1。本研究用重組DENV-1EDⅢ免疫新西蘭白兔制備抗EDⅢ多克隆免疫兔血清,全面分析了抗EDⅢ兔血清與DENV-1感染患者恢復期血清中EDⅢ反應抗體的中和保護作用與ADE效應,探索EDⅢ作為亞單位疫苗候選抗原的可能性。我們分析了30份DENV-1感染患者恢復期血清的中和活性與EDⅢ結合抗體滴度的關系,使用Spearman相關性分析,結果顯示患者血清與EDⅢ蛋白結合的抗體滴度遠低于中和滴度,且兩者不相關；說明EDⅢ抗體與DENV感染的中和保護性沒有關聯(lián)。進一步從30份患者血清中,隨機挑選6份去除患者血清中EDⅢ反應抗體,結果發(fā)現(xiàn)去除EDⅢ抗體前后,患者血清對同型和異型DENV的中和活性與增強活性均沒有變化。說明DENV感染患者血清中EDⅢ抗體作用微弱,與其他研究團隊結果相一致。兔抗DENV-1 EDⅢ血清對同型DENV的中和活性為較高稀釋度1：50,000,增強活性較低為1：5,000；值得注意的是,兔抗EDⅢ血清對異型DENV感染的增強峰值僅為1：40,這提示EDⅢ免疫原免疫兔子,體內產生的EDⅢ反應抗體在二次異型感染中是安全的。去除兔抗EDⅢ血清的EDⅢ反應抗體后,中和活性與增強活性全部消失。這說明雖然DENV EDⅢ不是登革病毒自然感染過程中的主要抗原,但是純化或重組的DENV EDⅢ仍然能夠作為亞單位疫苗,刺激有效安全的免疫應答反應。小結本課題使用酵母表面展示蛋白技術和定點突變技術,獲得EDⅢ交叉反應性抗體特異性識別高度保守的aa310-319序列的關鍵殘基,位于EDⅢ蛋白AB環(huán)的Q316和H317。為了全面評估DENV抗體和血清的增強感染的性能,首次建立基于NS1蛋白捕獲ELISA的ADE檢測(ELISA-ADE)方法,在96孔板上實施高通量簡便的檢測,與前期建立的檢測中和性能ELISPOT-MNT方法學聯(lián)合運用,全面評價DENV抗體和血清的增強和中和保護性能。這進一步為探索免疫治療性抗體,以及評估DENV疫苗的安全性和有效性提供有效的、高通量、簡便的技術手段。在前期建立穩(wěn)定方法學的基礎上,使用重組DENVEDⅢ蛋白免疫家兔,獲得抗EDⅢ的兔多克隆抗體血清,證實抗DENV-1 EDⅢ兔血清中的EDⅢ反應抗體在中和活性和增強活性中起關鍵作用,并且抗EDⅢ兔血清對二次異型DENV感染是安全的。同時印證了DENV-1感染患者恢復期血清中EDⅢ抗體的中和與增強功能甚微。這提示雖然DENV EDⅢ在登革病毒自然感染過程中的不是關鍵保護與增強作用的免疫原,但是純化或重組的DENY EDⅢ仍然能夠作為有潛力的亞單位疫苗,刺激有效安全的免疫應答反應。
【關鍵詞】：登革病毒 包膜蛋白Ⅲ區(qū) 中和活性 抗體依賴的增強作用 感染血清 兔血清
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R446.6
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-20
• 前言20-26
• 第一章 DENV EDⅢ交叉反應單克隆抗體識別表位的關鍵殘基的確定26-47
• 1 材料與方法27-40
• 2 結果40-44
• 3 討論44-46
• 4 小結46-47
• 第二章 建立高通量簡便的方法評價DENV抗體和血清的增強功能47-72
• 1 材料與方法48-61
• 2 結果61-68
• 3 討論68-71
• 4 小結71-72
• 第三章 DENV-1感染患者血清和兔抗EDⅢ血清的EDⅢ抗體的功能研究72-99
• 1 材料與方法72-81
• 2 結果81-96
• 3 討論96-97
• 4 小結97-99
• 全文總結99-101
• 參考文獻101-109
• 中英文縮寫詞109-112
• 在讀期間發(fā)表及待發(fā)表的文章112
• 在讀期間所獲獎勵112-113
• 致謝113-114

  本文關鍵詞：登革病毒包膜蛋白EDⅢ抗體中和活性與增強活性研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：385080